Identificación de nuevas proteínas de división celular de Mycobacteriales mediante proteómica de proximidad en células vivas

Abstract

La división celular bacteriana es un proceso esencial y altamente regulado, en el que participan dos complejos multiproteicos: el elongasoma y el divisoma. Estos complejos constituyen la maquinaria celular responsable de llevar a cabo la elongación y la división celular respectivamente, y han comenzado a ser caracterizados en bacilos modelo como Escherichia coli y Bacillus subtilis. Sin embargo, en bacterias del orden Mycobacteriales, estos procesos presentan particularidades asociadas a su modo de crecimiento polar asimétrico y a su envoltura celular compleja. De hecho, este grupo de bacterias carece de proteínas homólogas a muchos de los componentes esenciales del elongasoma y del divisoma en los organismos modelo. Con respecto al divisoma, si bien su proteína central, FtsZ (del inglés, Filamenting temperature sensitive mutant Z), está altamente conservada, muchos de los componentes que se reclutan a este complejo en los modelos clásicos, incluidas las proteínas que anclan el anillo Z a la membrana, están ausentes en los genomas de las Mycobacteriales. Más aún, a diferencia de otras bacterias, existen sólidas evidencias de que la fosforilación de proteínas juega un rol clave en la regulación de la elongación y la división celular en este grupo de bacterias. En esta tesis, nos propusimos identificar las proteínas que cumplen las funciones de las piezas faltantes en la maquinaria de división celular de Mycobacteriales y evaluar el posible rol de la fosforilación de proteínas en este proceso. Para ello, se exploró el entorno proteómico de FtsZ en células vivas bajo diferentes contextos de fosforilación. Con este objetivo, se desarrolló y validó una estrategia proteómica basada en biotinilación por proximidad mediante el uso de una ascorbato peroxidasa ingenierizada en células vivas, utilizando a Corynebacterium glutamicum como organismo modelo. La aplicación de esta estrategia permitió identificar un conjunto de proteínas vecinas de FtsZ en condiciones fisiológicas. Entre ellas, se destacan proteínas de división celular previamente reportadas, lo que valida la estrategia experimental empleada, así como nuevas proteínas de membrana cuya función en el ensamblaje del divisoma es aún desconocida. Para este último grupo, se confirmó su localización en el septo, lo que las posiciona como posibles nuevos integrantes del divisoma en Mycobacteriales. Por otro lado, utilizando una cepa knockout para una de las quinasas Ser/Thr involucradas en el control de la división celular, se evidenciaron cambios fenotípicos asociados a defectos en la división celular, así como cambios en la composición del entorno proteómico de FtsZ, lo que permite comenzar a comprender el rol de la fosforilación de proteínas en la composición y el funcionamiento del divisoma en Mycobacteriales. En conjunto, este trabajo aporta una estrategia novedosa para estudiar interacciones proteína-proteína en bacterias vivas del orden Mycobacteriales y demuestra su aplicabilidad para caracterizar la arquitectura molecular del divisoma. Los resultados obtenidos amplían el conocimiento actual sobre la composición del divisoma de C.glutamicum, y evidencian la importancia de la fosforilación mediada por PknA en la regulación de la división celular.