Diseño, evaluación y caracterización de nuevos derivados de benzisotiazolonas como agentes tripanosomátidos multi-blanco

Abstract

En la última década y según la OMS, las enfermedades tropicales desatendidas (ETD) continúan siendo uno de los mayores retos de la salud pública global, afectando a más de mil millones de personas en regiones de bajos recursos. Entre ellas, la tripanosomiasis americana (enfermedad de Chagas), la tripanosomiasis africana humana ("enfermedad del sueño”) y la leishmaniasis destacan por su impacto sanitario y socioeconómico. A pesar de los esfuerzos internacionales, solo un nuevo fármaco fue aprobado para el tratamiento de la "enfermedad del sueño”, el fexinidazol, mientras que la enfermedad de Chagas aún se trata con fármacos desarrollados más de 50 años atrás, el nifurtimox (NFX) y el benznidazol (BNZ). Estos últimos presentan eficacia limitada en la fase crónica de la enfermedad y una marcada toxicidad, lo que denota la necesidad de descubrir y desarrollar nuevas entidades químicas superadoras. La presente tesis se centró en el diseño racional, síntesis, caracterización y evaluación de una nueva familia de 23 derivados de benzisotiazolonas con actividad antitripanosomátidos multidiana. Se seleccionó este andamio estructural tomando en cuenta que compuestos análogos (como el Ebsulfur: EbS, y el derivado con selenio Ebselen: EbSe) mostraron poseer actividad tripanocida e inhibitoria de las enzimas encargadas de la síntesis (tripanotión sintetasa: TryS) y reducción (tripanotión reductasa: TR) del principal tiol de bajo peso molecular de estos organismos, el tripanotión. Los compuestos sintetizados fueron caracterizados mediante RMN (1H y 13C) y espectrometría de masas. A partir del análisis quimioinformático, los compuestos se agruparon en cinco series para correlacionar las variaciones químicas con sus bioactividades. La evaluación biológica frente a Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi y Leishmania infantum permitió identificar varios compuestos con actividades destacadas, aunque especie-específicas. La mayoría de ellos ejerció una citotoxicidad potente y selectiva contra T. b. brucei (ej. derivado 14: CE50 = 0,0ββ 􀈝ε, IS = 677β, el 11μ 0,0λ1 􀈝ε, IS = 46β y el 1γμ 0,β1 􀈝ε; IS > λ5β), la cual fue similar o superior a la del EbS. Para T. cruzi, el compuesto 16 (CE50 = 2,1γ 􀈝ε; IS > λ4) resultó ser el más activo y comparable a BNZ, mientras otros derivados presentaron actividad micromolar baja con índices de selectividad superiores a 10. Notablemente, la mayoría de los compuestos careció de actividad contra 6 L. infantum, confirmando la especificidad de los nuevos derivados por blancos moleculares presentes en tripanosomas. Para indagar sobre el modo de acción de los compuestos más activos y teniendo en cuenta evidencias previas sobre la actividad pro-oxidante del EbS y el EbSe, los compuestos activos fueron ensayados contra una línea celular de T. b. brucei reportera del estado redox del metabolismo dependiente de tioles. Se verificó que la gran mayoría de los compuestos inducen la oxidación intracelular del pool de tioles de bajo peso molecular, afectando así la homeostasis redox. En base a estos resultados y para verificar nuestra hipótesis de diseño racional de derivados del EbS como inhibidores de TryS y TR, se estudió la inhibición de estas enzimas exclusivas de tripanosomátidos para los compuestos con mayor actividad bioselectiva. A diferencia del EbS y el EbSe, solo dos o cinco de los nuevos derivados logró inhibir más del 50% la actividad de la TryS y TR a concentraciones inferiores a 70 􀈝ε, respectivamente. En el marco de esta tesis se empleó el análisis de anclaje y dinámicas moleculares para comprender cómo la unión covalente de EbS y EbSe a la Cys270 de TryS afecta la actividad enzimática. En estudios previos de análisis de espectrometría de masas, este residuo había sido identificado estar modificado covalentemente por estos compuestos. Los resultados sugieren que la unión del compuesto a esta cisteína está favorecida por el entorno hidrofóbico y que el anclaje del compuesto a esta región altera la conformación del sitio activo de la enzima (principalmente la región de unión a ATP). Para uno de los inhibidores de TR (compuesto 7), verificamos experimentalmente que éste se une de manera covalente a la Cys221 (parcialmente expuesta al solvente) y que dicha unión afecta el correcto anclaje del NADPH al sitio activo de la enzima, lo cual explica el mecanismo de inhibición parcialmente irreversible observado mediante estudios cinéticos. En base a reportes previos que indican que el EbSe afecta el metabolismo de la glucosa por inhibir a la enzima Hexoquinasa (HK-1), se estudió si los derivados más activos y selectivos ejercen un efecto similar en la forma infectiva de T. b. brucei, la cual posee un metabolismo energético dependiente del glicólisis. A diferencia del EbSe, la mayoría de los derivados no afectaron la tasa de consumo de glucosa o tres de ellos (incluyendo al EbS) lo hicieron de manera marginal (10%). Esto sugiere que HK-1 no es el principal blanco molecular de los nuevos compuestos. 7 Con el fin de orientar futuras optimizaciones, se desarrolló un modelo QSAR tridimensional (CoMFA) que correlacionó propiedades estéricas y electrostáticas con la actividad frente a T. b. brucei. Este análisis indicó que sustituyentes voluminosos y grupos halogenados o metoxilo correlacionan positivamente con actividad. La eficacia terapéutica del compuesto 14 fue evaluada en un modelo murino agudo de infección por T. b. brucei, observándose una reducción parcial de la carga parasitaria y una extensión significativa de la supervivencia de los animales infectados sin signos de toxicidad. Este hallazgo validó a este compuesto como candidato a ser optimizado. Metodológicamente, en el marco de esta tesis se desarrollaron ensayos y modelos (ej. viabilidad celular y estado redox basados en proteínas reporteras luminiscentes y fluorescentes) innovadoras que ofrecieron un marco experimental robusto y fisiológicamente relevante para el estudio de compuestos en las formas clínicas de estos patógenos. También se participó en el desarrollo de un modelo de infección de organoides murinos (colon) por T. cruzi. Los resultados de esta investigación constituyen la primera caracterización sistemática de benzisotiazolonas frente a tripanosomátidos. Las contribuciones originales incluyen: (i) la expansión del andamiaje de EbS hacia derivados con perfiles de potencia y selectividad superiores a NFX y BNZ, (ii) la identificación de relaciones estructura-actividad especie-específicas que permiten aplicar nuevas estrategias de diseño selectivo, y (iii) la implementación de plataformas metodológicas aplicables al descubrimiento de fármacos. Estos hallazgos posicionan a las benzisotiazolonas en la etapa hit-to-lead, con bases sólidas para estudiar y optimizar su farmacocinética, así como avanzar en su desarrollo preclínico. Por tanto, este estudio constituye una contribución original al campo de la química medicinal aplicada a enfermedades tropicales desatendidas.