Análisis de plataformas genéticas codificantes de resistencia en Klebsiella pneumoniae productora de carbapenemasa y evaluación de compuestos antibiofilm

Abstract

Klebsiella pneumoniae (Kp) es una bacteria oportunista asociada a infecciones intrahospitalarias graves, como neumonías, infecciones del tracto urinario, bacteriemias y heridas quirúrgicas. En los últimos años, su capacidad para adquirir diversos mecanismos de resistencia a los antibióticos, incluyendo la producción de carbapenemasas, la ha convertido en una de las principales amenazas para la salud pública a nivel global. El surgimiento cada vez más frecuente de aislamientos pan-resistentes sumado con su habilidad de formación de biofilm, que dificulta los tratamientos con antibióticos, refuerzan la urgencia de desarrollar estrategias de vigilancia epidemiológica y la búsqueda de terapias alternativas o complementarias. En este contexto, la presente tesis tuvo como objetivo contribuir al entendimiento de la resistencia antimicrobiana en Kp multirresistente y vías de diseminación de la misma, así como evaluar el potencial antibiofilm de distintos compuestos. Con este fin, se analizaron dos grupos de aislamientos clínicos de Kp: el primero representado por dos co-aislamientos pertenecientes a un brote de Kp productora de carbapenemasa tipo KPC (Kp-KPC) del año 2011, obtenidos simultáneamente de la herida quirúrgica de un paciente trasplantado; y el segundo por cinco aislamientos de Kp productores de metalocarbapenemasa tipo NDM (Kp-NDM) y resistentes a colistina, recolectados en 2023. Todos los aislamientos fueron caracterizados fenotípicamente, basado en el perfil de resistencia a antibióticos y en la capacidad de producción de biofilm. Además, los dos aislamientos Kp-KPC y 3 de los 5 aislamientos Kp-NDM fueron seleccionados para análisis genotípico mediante técnicas de secuenciación masiva para la identificación de genes de resistencia y el análisis de las plataformas genéticas involucradas. Por otro lado, se evaluaron el polipéptido colistina y varios complejos metálicos sintetizados localmente por la cátedra de Inorgánica de Facultad de Química, como potenciales agentes antibiofilm. Todos los aislamientos presentaron un alto número de genes de resistencia a diferentes clases de antibióticos. Los aislamientos de Kp-KPC productores de KPC-2 (54-1 y 54-2) pertenecieron al secuenciotipo ST437 y fueron sensibles a la colistina. Los aislamientos de Kp-NDM revelaron la presencia de NDM-5, una variante recientemente reportada en nuestro país, y pertenecieron al secuenciotipo ST307, un clon epidémico de alto riesgo introducido hace poco en la región. Además, presentaron valores de concentración inhibitoria mínima a la colistina entre 16 y 64 μg/mL. Basado en el cgMLST y en la diferencia en el número de SNPs se observó que los aislamientos de Kp-KPC (54-1 y 54-2) pertenecieron al mismo clon (diferencia de 6 SNPs), mientras que los aislamientos de Kp-NDM pertenecieron a dos clones distintos (distinto valor de cgMLST y diferencia de 70 SNPs). El gen blaKPC-2 se localizó en un plásmido IncN formando parte de un transposón Tn4401. Los plásmidos IncN compartieron un alto porcentaje de homología, y su composición denotaba una estructura simple con blaKPC-2 como único gen de resistencia. A diferencia de este, el gen blaNDM-5 fue encontrado en plásmidos multireplicones IncR/incN e IncFIB/IncFII de 48 y 230 kb respectivamente. En todos los casos el entorno genético de blaNDM-5 fue similar (ΔISA-ba125/blaNDM-5/bleMBL/trpF/dsbD) y se encontró formando parte de una región multirresistente de aproximadamente 20 Kb compuesta por múltiples secuencias móviles (Iss, Tn, integron) y genes de resistencia a diferentes clases de antibióticos. Dos de los tres aislamientos Kp-NDM tuvieron dos copias de blaNDM-5 en distintos plásmidos. Dos de los aislamientos estudiados, revelaron la presencia de la β-lactamasa de espectro extendido CTX-M-15. El gen blaCTX-M-15 que codifica para dicha enzima se localizó en plásmidos con distinto grupo de incompatibilidad: IncFIB, IncHI2/ IncHI2A/RepA y IncFIB/IncFII, formando parte de regiones multirresistentes de 20Kb con alto contenido de elementos genéticos móviles. El entorno genético de este gen fue conservado en todos los casos, con la organización típica ISEcp1/blaCTX-M-15/wbuC/tnpA. En uno de los aislamientos, se identificaron 3 copias de blaCTX-M-15, ubicadas en plásmidos diferentes. En uno de ellos, se observó un evento de intercambio genético, donde blaNDM-5 fue sustituido por blaCTX-M-15, evidenciando la plasticidad de estos genes. Los plásmidos multirresistentes codificantes de blaNDM-5 o blaCTX-M-15 albergan un alto número de genes de resistencia, lo que implica que su transferencia está asociada a la co-transferencia de múltiples genes de resistencia de importancia clínica, facilitando la diseminación de la misma y dando lugar al origen de aislamientos multirresistentes. Además, la capacidad de NDM-5 y CTX-M-5 de integrarse en plásmidos con múltiples orígenes de replicación pone de manifiesto las estrategias de diseminación que facilitan su persistencia en los clones epidémicos de alto riego y contribuyen a su éxito en los entornos hospitalarios. Todos los aislamientos mostraron capacidad para formar biofilm, siendo catalogados como moderados o fuertes productores. Por otro lado, se evaluó la capacidad de distintos compuestos para inhibir y/o erradicar el biofilm de Kp. La colistina fue capaz de inhibir la formación de biofilm a concentraciones sub inhibitorias, mostrando una mayor efectividad en los aislamientos resistentes a este antibiótico. Se encontró que algunos complejos metálicos presentaron una actividad antibiofilm significativa. Entre ellos, las sulfonamidas de plata mostraron los mejores resultados tanto en la inhibición como en la erradicación del biofilm, abriendo nuevas posibilidades en la búsqueda de estrategias terapéuticas complementarias. Esta tesis integra el análisis genómico y fenotípico para aportar conocimiento sobre la resistencia y diseminación de Kp multirresistente en Uruguay, destacando la emergencia del clon de alto riego ST307 y la detección por primera vez de la metalo-β-lactamasa NDM-5 en nuestro país. Asimismo, este trabajo ofrece una aproximación preliminar al uso de nuevos compuestos metálicos como potenciales agentes antibiofilm.