Puesta a punto de pruebas de PCR para la detección de Clostridium chauvoei, agente causal de miositis necrotizante (“mancha") en bovinos

Abstract

La “mancha” es una enfermedad infecciosa bacteriana causada por el patógeno anaerobio Clostridium chauvoei que afecta principalmente al ganado bovino. Se caracteriza por ocasionar miositis necrotizante aguda con desenlace fatal por toxemia, generalmente en ganado joven (terneros), afectando la economía de los sistemas ganaderos. A nivel laboratorial, es de difícil diagnóstico etiológico por métodos bacteriológicos tradicionales (cultivo anaerobio), debido a que el agente causal es anaerobio estricto y pierde rápidamente su viabilidad en muestras tomadas a campo de animales muertos, si estas no son mantenidas en condiciones de anaerobiosis y remitidas rápidamente al laboratorio veterinario. Dada esta dificultad, la probabilidad de éxito en el diagnóstico etiológico aumenta en laboratorios que disponen de pruebas que permitan la detección del patógeno en muestras bovinas, incluso cuando este no está viable, como las pruebas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El presente trabajo describe una serie de casos de “mancha” en bovinos de Uruguay y se centra en poner a punto dos pruebas de PCR en tiempo final (protocolos 1 y 2) para la detección de ADN específico de C. chauvoei, una sobre muestras congeladas para la que se utilizaron cebadores para detectar el gen de la flagelina (flagellin gen) de 535 pb (protocolo 1) y otra a partir de tejido muscular formolado-parafinado usando cebadores de 131 pb para detectar el gen de la toxina A (CctA) de este agente (protocolo 2). Para esto se dispuso de 3 aislados de C. chauvoei obtenidos en el laboratorio de la PSA de INIA La Estanzuela, los que fueron re-cultivados, permitiendo el análisis y la caracterización de su perfil bioquímico. Uno de los tres aislados fue empleado para elaborar controles positivos de ambas matrices (tejido muscular congelado y tejido muscular formolado-parafinado) para poner a punto los dos protocolos de PCR, utilizando ambas matrices sin inocular como controles negativos. Un aislado de Clostridium perfringens fue utilizado para evaluar reacciones cruzadas de ambos protocolos frente a este agente en ambas matrices. Los dos protocolos de PCR fueron efectivos y mostraron buen desempeño en la detección de C. chauvoei. Los mismos fueron probados en el análisis de muestras clínicas de casos reales de mancha, usando un caso de gangrena gaseosa (miositis por C. perfringens) como control negativo. En particular del protocolo para tejidos formolados/parafinados, donde se emplearon diluciones del ADN extraído, se pudo inferir que una dilución adecuada puede mejorar la eficiencia de amplificación. Ninguno de los protocolos detectó C. perfringens, lo que contribuye a su especificidad. Se concluye que ambos protocolos son confiables y aplicables para la detección de C. chauvoei sobre muestras clínicas, por lo que pueden incorporarse a la rutina diagnóstica ante casos con sospecha de “mancha” en bovinos.