Métodos de extracción, enriquecimiento, aislamiento y caracterización estructural de saponinas de Quillaja brasiliensis

Abstract

Quillaja brasiliensis (A. St.-Hil. & Tul.) Mart. (Quillajaceae) es una de las dos únicas especies del género Quillaja Molina. La segunda y más estudiada es la especie chilena Quillaja saponaria Molina, principal fuente de saponinas de uso industrial y biotecnológico. De manera análoga a su congénere, las saponinas presentes en partes aéreas de Q. brasiliensis, en forma libre o como componente de formulaciones coloidales, han demostrado ser muy efectivas como adyuvantes en vacunas experimentales, pudiendo provocar una respuesta humoral y celular temprana contra los antígenos coadministrados. Hasta el momento, se ha demostrado que fracciones purificadas de saponinas obtenidas a partir de hojas de Q. brasiliensis poseen actividad inmunoadyuvante comparable con Quil-A®, el principal producto adyuvante comercial basado en saponinas provenientes de la corteza de Q. saponaria. Sin embargo, debido a su alta reactogenicidad Quil-A®, ha sido incluida exclusivamente en formulaciones de uso veterinario. Se ha evidenciado que algunas saponinas presentes en Quil-A® como QS-21, mezcla de dos saponinas isoméricas, propicia menores efectos secundarios que la mezcla manteniendo las propiedades inmunoadyuvantes. Actualmente, existen vacunas aprobadas para uso humano que contienen QS-21 como adyuvante y, en un contexto postpandemia, hace a la corteza de Q. saponaria un suministro limitado de este producto natural derivando en la búsqueda de una nueva fuente de estos compuestos. En consideración del creciente conocimiento sobre la potencialidad de las saponinas de Q. brasiliensis como agentes inmunoadyuvantes, esta especie constituye una fuente botánica muy prometedora para el desarrollo de productos biotecnológicos de alto valor. Este trabajo tuvo como uno de los objetivos el desarrollo de procesos de enriquecimiento en saponinas de forma de obtener productos definidos de composición y propiedades estandarizadas. El método de enriquecimiento en saponinas por extracción en fase sólida (SPE) permitió, a partir de hojas y corteza de un individuo adulto, la obtención de dos fracciones definidas principales llamadas FBH y FBC, respectivamente. A partir de estas fracciones, por DI-ESI-IT-MS3 y UHPLC-ESI-IT-MS2 en combinación con métodos químicos clásicos de análisis de azúcares y metilación fueron caracterizadas preliminarmente 48 y 54 saponinas triterpénicas respectivamente. Estas saponinas fueron caracterizadas de acuerdo al estudio de las fragmentaciones a partir del ion pseudomolecular y fueron agrupadas respecto a saponinas homólogas de Q. saponaria. Tomando en cuenta esta metodología y el conocimiento generado se desarrollaron iv técnicas UHPLC-ESI-IT-MS1 y HPLC-DAD para la determinación de saponinas totales en extractos enriquecidos obtenidos a partir de hojas. Dados los indicios de la presencia de isómeros o análogos de QS-21 también se estudió la presencia de los mismos en extractos cuya metodología de producción es factible a ser escalada. Otro de los objetivos consistió en la extracción, aislamiento y elucidación estructural de las principales saponinas presentes en Q. brasiliensis de las cuales al momento solo existía información parcial acerca de una prosapogenina compuesta por ácido quillájico acoplado a ácido glucurónico. A partir de FBH se realizó el aislamiento y elucidación estructural de cuatro saponinas triterpénicas que se denominaron Qb1, Qb2, Qb3 y S13, de las cuales las tres primeras constituyen nuevas estructuras y la restante (S13) fue reportada previamente en corteza de Q. saponaria. El aislamiento y elucidación de las saponinas fue llevado a cabo combinando técnicas cromatográficas como MPLC y HPLC-Prep y técnicas de MS y RMN en una y dos dimensiones. El monitoreo de la separación por LC-MS permitió enfocar el aislamiento principalmente hacia isómeros de QS-21, compuestos de potencial valor y actividad teniendo en cuenta las similitudes estructurales relativas a la actividad inmunoadyuvante. Se evaluaron nuevas actividades biológicas inherentes a compuestos presentes en hojas de Q. brasiliensis. Se determinó la capacidad adyuvante de fracciones enriquecidas en saponinas (FBH y FBC) y saponinas puras (Qb1) como componentes en una vacuna experimental contra el virus de la Hepatitis E genotipo 3. El título de anticuerpos determinado al ensayar FBH, FBC y Qb1 fue casi el doble que Quil-A®. Esto indicaría que son adyuvantes muy potentes, y que Qb1 podría tener propiedades semejantes a su isómero QS-21. En este ensayo se evaluó por primera vez la actividad adyuvante de una fracción enriquecida y definida en saponinas provenientes de la corteza y especialmente una saponina pura aislada y elucidada a partir de hojas de Q. brasiliensis. En forma complementaria, se demostró la actividad antihelmíntica de un extracto enriquecido en saponinas y de un glicósido aislado del tipo diterpeno fenólico puro. Se pudo comprobar que este compuesto se encuentra presente en el extracto acuoso, acetónico y derivados purificados como FBH. Por medio de este trabajo se pudo comprobar que los compuestos presentes en Q. brasiliensis, en particular las saponinas surgen como nuevas alternativas para el control de nemátodos gastrointestinales bovinos. El conocimiento generado en este trabajo propende a la revalorización de la flora autóctona, contribuyendo así a su conservación.