Rituximab y sus fragmentos Fab como potenciales agentes de imagen del nivel de expresión del antígeno CD20 en Melanoma

Abstract

El melanoma es una de las formas más agresivas de cáncer de piel. Su tasa de incidencia ha presentado el mayor crecimiento en el mundo, observándose un aumento en su incidencia y mortalidad en Uruguay. Se ha visto que, en melanoma, al igual que otros tumores malignos, posee subpoblaciones celulares distintas. Una de estas subpoblaciones está representada por una población celular que posee capacidad de autorrenovación, diferenciación, tumorigenicidad y / o resistencia a medicamentos, las cuales son capaces de expresar el antígeno CD20. Este antígeno fue identificado inicialmente en un porcentaje pequeño de células de melanoma de esferas no adherentes humanas al ser cultivadas en un medio de células madres embrionarias; por lo cual a estas células de melanomas CD20 positivas se las denominó como células madres tumorales debido a que poseen capacidad de autorrenovación, expresan una tumorigenicidad hasta 10 veces mayor que las células de melanomas adherentes y tienen la capacidad de diferenciarse en varios linajes celulares. El anticuerpo anti-CD20 (Rituximab) es un anticuerpo monoclonal quimérico murino humano IgG1 κappa, que se une específicamente al antígeno de superficie CD20, y tiene un peso molecular de aproximadamente 145 kDa. La especificidad dirigida del anticuerpo monoclonal anti-CD20 ha quedado demostrada en un gran número de estudios in vitro. Posee una afinidad aparente (IC50) de aproximadamente 8,0 nM. Mientras que el dominio Fab del anticuerpo se une al epítope del antígeno CD20, el dominio Fc recluta células efectoras inmunes para mediar en la lisis de las células B, in vitro. El diagnóstico inicial de melanoma maligno de piel se basa en la inspección clínica y en la biopsia. La estadificación se realiza de acuerdo a la clasificación de la American Joint Committee on Cancer (AJCC) basado en el espesor del tumor y la presencia de ulceración confirmado por histopatología. Generalmente el CT, RMN, y el PET con 18FDG son capaces de identificar el melanoma con sensibilidad y especificidad variable dependiendo de su tamaño y localización. Sin embargo, no existe una indicación para imagen en el diagnóstico primario. Dado a que el anticuerpo Rituximab, es capaz de unirse específicamente al antígeno CD20, el presente trabajo comprende el diseño, síntesis, desarrollo y evaluación preclínica del Rituximab y sus fragmentos Fab en melanoma; marcados con [99mTc]Tc, como potenciales agentes de imagen molecular para diagnóstico de melanoma. En el presente trabajo se logró poner a punto las técnicas de fragmentación del anticuerpo, así como la derivatización con el agente quelante bifuncional (HYNIC) de ambas biomoléculas y su posterior radiomarcación con [99mTc]Tc. Los valores obtenidos de las purezas radioquímicas resultaron acordes a lo esperado; dado que el propósito del presente trabajo fue obtener un radiotrazador para ser utilizado en pacientes con melanoma, y esto implica que se obtengan purezas radioquímicas mayores al 90 %. A su vez, las estabilidades y los ensayos de competencia resultaron también acorde a lo esperado. La evaluación del nivel de expresión de CD20 y la respectiva unión por parte del Rituximab y su fragmento Fab a este, fue realizada mediante estudios por citometría de flujo como por microscopía láser confocal en distintas líneas celulares de Melanoma murino (B16F1, B16F10 y TM1MT). Mediante estos estudios se logró comprobar que estas líneas celulares expresan CD20 y ambas biomoléculas empleadas son capaces de unirse a dicho antígeno. Es por ello que fueron empleadas dichas líneas celulares para ser inyectadas en ratones C57BL/6J y de esta forma que sean empleados como modelos para los ensayos biológicos in vivo. La evaluación in vitro realizada en las mencionadas líneas celulares de melanoma murino, junto con un control negativo, reveló una significativa unión de las biomoléculas radiomarcadas a dichas líneas. A su vez, se demostró la especificidad de dicha unión mediante ensayos de bloqueo empleando el anticuerpo Rituximab y sus fragmentos Fab sin marcar. La estabilidad in vivo fue verificada a través de estudios de biodistribución e imagenológicos en ratones C57BL/6J normales y C57BL/6J portadores de tumores inducidos mediante la inoculación de células de Melanoma Murino B16F10, B16F1 y TM1MT Los estudios de biodistribución llevados a cabo empleando [99mTc]Tc-HYNIC-Rituximab en ratones C57BL/6J normales, mostraron que el complejo radiomarcado posee una lenta eliminación sanguínea y una significativa absorción por el hígado y tracto gastrointestinal. Mientras que los estudios de biodistribución empleando [99mTc]Tc-HYNIC-Fab(Rituximab) revelaron que el complejo presenta una rápida depuración sanguínea, con eliminación renal principalmente, y ausencia de captación apreciable en otros órganos. Las biodistribuciones en ratones portadores de tumores inducidos demostraron una acumulación preferencial de ambas biomoléculas radiomarcadas a nivel tumoral, con una relación tumor/músculo mayor a 4 para ambos compuestos. Los ensayos imagenológicos obtenidos por SPECT/CT y por Resonancia Magnética confirmaron la captación y visibilidad tumoral en todos los modelos de melanoma murino evaluados. Por lo anterior, hemos desarrollado dos prometedores radiotrazadores para diagnóstico imagenológico de Melanoma. Es esencial seguir investigando para optimizar estos agentes de imagen y dilucidar plenamente su aplicación clínica en Melanoma. Es fundamental destacar la invaluable experiencia adquirida durante el transcurso del presente trabajo en el campo de la Imagenología Molecular.