Estrategias no tradicionales de inmovilización para la obtención de biocatalizadores basados en cepas de Gluconobacter

Abstract

El objetivo general de esta Tesis fue profundizar en el estudio del potencial de cepas inmovilizadas de Gluconobacter como biocatalizadores en la obtención de compuestos de interés industrial. Se planteó la hipótesis de que estrategias no tradicionales de inmovilización mejorarían significativamente la aplicabilidad industrial de las cepas de Gluconobacter, permitiendo una producción eficiente de compuestos a partir de glicerol y sus derivados. En particular, se esperaba que las cepas mutantes de Gluconobacter y su inmovilización en soportes no convencionales mejoraran la producción de ácido glicérico (AG) y otros compuestos, mientras que la implementación de cascadas biocatalíticas integradas permitieran la síntesis efectiva de productos aminados. Se realizó un análisis sobre la capacidad de oxidación de Gluconobacter oxydans (Gox) en derivados de glicerol con el objetivo de obtener cetonas útiles para la síntesis de compuestos aminados. Se logró mejorar la producción de AG utilizando células en reposo de Gluconobacter frateurii (Gfr), desarrollando una metodología económica que también serviría como control para futuras reacciones con preparaciones inmovilizadas. Los resultados Obtenidos demostraron un notable potencial de las cepas Gox y Gfr para la obtención de compuestos oxidados a partir de glicerol, con la producción de dos cetonas nuevas, 1-etoxi-3-hidroxipropan-2-ona (EHA) y 1-hidroxi-3-(2,2,2-trifluoroetoxi)propan-2-ona (3FHA), y la capacidad de obtención de AG por células en reposo utilizando solamente agua. Asimismo, se utilizaron técnicas de modificación genética racional para generar mutantes de Gluconobacter, obteniéndose cepas fluorescentes de Gfr y Gox que expresan la proteína mCherry, lo que resultó fundamental para el estudio de la arquitectura de preparaciones inmovilizadas. Además, se abordó el desarrollo de un mutante de Gfr capaz de producir únicamente AG a partir de glicerol sin la acumulación del coproducto dihidroxiacetona (DHA) utilizando herramientas CRISPR. Esto sienta un antecedente sin precedentes en la modificación genética de esta cepa utilizando este abordaje. Se evaluaron diversas técnicas no tradicionales de inmovilización en Gluconobacter, incluyendo el atrapamiento en matrices híbridas de polímeros orgánicos y materiales nanoparticulados, la integración con nanomateriales silíceos, la generación de cubiertas unicelulares y la unión a materiales obtenidos por impresión 3D. Los resultados subrayaron la importancia de la inmovilización como estrategia de estabilización de este biocatalizador, y de seleccionar adecuadamente la matriz de inmovilización para mejorar los resultados en las biotransformaciones. Finalmente, se diseñó e implementó una estrategia innovadora de co-inmovilización para combinar biocatalizadores enzimáticos con cepas de Gluconobacter, permitiendo la realización de una cascada en formato 1-Pot para la preparación de serinol. En un abordaje inédito, esta estrategia utilizó esporas artificiales decoradas con una transaminasa inmovilizada por colas de histidina en la superficie bacteriana. Asimismo, se utilizó una nueva estrategia de funcionalización sobre nanopartículas de sílica biomimética para la inmovilización de la transaminasa. Este inmovilizado se logró acoplar en una reacción en 2-Pot en conjunto con Gox, donde el etil gliceril eter (EGE) fue oxidado a EHA, siendo luego modificado por aminación reductiva para obtener 2-Amino-3- etoxipropan-1-ol (2A3EP). Este compuesto es una amina quiral con potencial en síntesis de fármacos, que nunca había sido sintetizado utilizando esta estrategia. Los resultados de esta Tesis Doctoral no solo avanzaron el conocimiento sobre el comportamiento de Gluconobacter como biocatalizador, sino que también contribuyeron a la biocatálisis y las biotransformaciones en general, con nuevas estrategias de mejora de procesos biosintéticos y biocatalizadores. Los estudios realizados han abierto varias nuevas líneas de investigación, que continúan siendo exploradas para expandir las aplicaciones y mejorar las reacciones biocatalíticas de Gluconobacter.