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Please use this identifier to cite or link to this item: https://hdl.handle.net/20.500.12008/43259 How to cite
Title: Caracterización de Escherichia coli productoras de toxina Shiga (STEC) recuperadas de canales bovinas uruguayas
Authors: Mussio Forteza, Paula
Obtained title: Doctor en Ciencias Médicas
University or service that grants the title: Universidad de la República (Uruguay). Facultad de Medicina.
Tutor: Varela, Gustavo
Leotta, Gerardo
Type: Tesis de doctorado
Descriptors: ESCHERICHIA COLI SHIGA-TOXIGÉNICA, ZOONOSIS, BOVINOS, SALUD PÚBLICA, RESERVORIOS DE ENFERMEDADES, ESTUDIO CLÍNICO
Issue Date: 2023
Content: Índice de Figuras. 7 -- Índice de Tablas 9 -- 1. Resumen 12 -- 2. Introducción 16 -- 2.1. Características generales de Escherichia coli 16 -- 2.2. Escherichia coli productor de toxina Shiga (STEC) 19 -- 2.3. Métodos para detectar, aislar y caracterizar STEC en el laboratorio 19 -- 2.3.1. Cultivo celular 21 -- 2.3.2. Métodos inmunológicos 21 -- 2.3.3. Métodos moleculares 22 -- 2.3.4. Serotipificación 25 -- 2.3.5. Subtipificación para estudios epidemiológicos y de población 26 -- 2.4. Patogenia de las infecciones por STEC 26 -- 2.4.1. Síndrome urémico hemolítico – SUH 27 -- 2.4.2. Serotipos STEC asociados a casos de SUH 28 -- 2.4.3. Genes de virulencia 29 -- 2.4.3.1. Factores de adherencia 30 -- 2.4.3.2. Toxina Shiga 33 -- 2.4.3.3. Factores adicionales de virulencia 36 -- 2.4.4. Resistencia Antimicrobiana (RAM) 40 -- 2.5. Enfermedades Transmitidas por Alimentos e incidencia de STEC 41 -- 2.5.1. Reservorio y transmisión de STEC a los seres humanos 44 -- 3. Justificación y Objetivos 48 -- 3.1. Objetivo general 50 -- 3.2. Objetivos específicos 50 -- 4. Metodología 51 -- 4.1. Obtención de muestras 52 -- 4.1.1. Recolección de datos sobre las variables de interés 53 -- 4.2. Procesamiento de las muestras en el laboratorio de Microbiología 53 -- 4.2.1. Enriquecimiento 53 -- 4.2.2. Tamizaje para genes stx y eae 54 -- 4.2.3. Aislamiento de STEC a partir de muestras positivas para stx y eae.............5 4.2.4. Detección y aislamiento de Escherichia coli O157:H7 59 -- 4.3. Análisis estadístico 62 -- 4.4. Selección de aislamientos STEC para su caracterización 63 -- 4.5. Caracterización fenotípica 63 -- 4.5.1. Resistencia antimicrobiana por el procedimiento de Disco difusión en agar (método de Kirby-Bauer) 63 -- 4.5.2. Caracterización fenotípica con MicroScan 66 -- 4.5.3. Serotipificación por aglutinación 71 -- 4.6. Caracterización genómica 72 -- 4.6.1. Secuenciación genómica completa 72 -- 4.6.2. Trabajo manual con las secuencias 72 -- 4.6.2.1. Ensamblado de contigs 72 -- 4.6.2.2. Búsqueda de genes de virulencia, resistencia antimicrobiana, serotipificación molecular y determinación del secuenciotipo (MLST y cgMLST) 74 -- 4.6.2.3. Identificación de profagos y plásmidos 77 -- 4.6.2.4. Filogrupos con ClermontTyping 78 -- 4.6.3. Análisis del pangenoma 78 -- 4.6.4. Uso de Aries 79 -- 4.6.4.1. Asociación filogenética por cgMLST 81 -- 4.6.5. Categorización de las cepas STEC seleccionadas de acuerdo al riesgo para la salud según los niveles de FAO/WHO 81 -- 5. Resultados 81 -- 5.1. Distribución de las muestras de medias canales analizadas en función de las variables en estudio 83 -- 5.2. Presencia de genes stx y eae en los caldos de enriquecimiento 85 -- 5.3. Asociación de factores con la presencia de genes stx en caldo 85 -- 5.3.1. Categoría animal 86 -- 5.3.2. Establecimiento de faena 86 -- 5.3.3. Tipo de faena 86 -- 5.3.4. Tipo de alimentación animal 87 -- 5.3.5. Estacionalidad 87 -- 5.3.6. Aplicación de intervenciones antimicrobianas (steam vaccum y/o ácidos orgánicos) 87 -- 5.3.7. Presencia de pelos en la media canal 87 -- 5.3.8. Análisis multivariado 87 -- 5.4. Aislamiento de STEC 88 -- 5.5. Detección y aislamiento de Escherichia coli O157:H7 89 -- 5.6. Selección de aislamientos STEC para su caracterización 90 -- 5.7. Caracterización fenotípica 91 -- 5.7.1. Resistencia antimicrobiana por la técnica de Disco difusión 91 -- 5.7.2. Caracterización fenotípica con MicroScan 93 -- 5.7.2.1. Identificación bioquímica 93 -- 5.7.2.2. Resistencia antimicrobiana según resultados de MicroScan 96 -- 5.7.3. Serotipificación por aglutinación clásica 98 -- 5.8. Caracterización genómica 98 -- 5.8.1. Ensamblado de contigs 100 -- 5.8.2. Búsqueda de genes de virulencia, resistencia antimicrobiana y serotipificación molecular 101 -- 5.8.2.1. Uso del Center for Genomic Epidemiology - CGE y Clermont Typer 101 -- 5.8.2.2. Determinación de subtipos de stx y búsqueda de otros genes vinculados a virulencia por PCR in silico 104 -- 5.8.3. Identificación de profagos y plásmidos 106 -- 5.8.4. Uso de Aries 109 -- 5.8.4.1. Asociación filogenética por cgMLST 112 -- 5.8.5. Análisis del pangenoma 113 -- 5.9. Categorización riesgo FAO/WHO 115 -- 6. Discusión 117 -- 6.1. Prevalencia genes stx y recuperación de STEC 117 -- 6.2. Asociación de variables estudiadas y la frecuencia de genes stx en caldo de enriquecimiento 119 -- 6.3. Prevalencia Escherichia coli O157:H7 121 -- 6.4. Identificación bioquímica por MicroScan 121 -- 6.5. Distribución de serotipos en las cepas STEC confirmadas por WGS 122 -- 6.6. Resistencia antimicrobiana 125 -- 6.7. Factores de virulencia 127 -- 6.7.1. Subtipos de stx y eae 127 -- 6.7.2. Factores de virulencia adicionales 129 -- 6.7.3. Secuenciotipos y filogrupos 132 -- 6.7.4. Identificación de profagos y plásmidos 135 -- 6.7.5. Estudio del pangenoma 135 -- 6.7.6. Asociación filogenética 136 -- 6.7.7. Categorización de riesgo FAO/WHO 137 -- 7. Conclusiones y Perspectivas 139 -- Referencias 142 -- 9. ANEXO I – ANÁLISIS ESTADÍSTICO 161
Abstract: Escherichia coli productor de toxina Shiga (STEC) es un microorganismo zoonótico que coloniza el tracto intestinal de los animales y causa en el hombre diarrea de severidad variable y enfermedades graves, entre ellas, el síndrome urémico hemolítico post-entérico por STEC (SUH-STEC). El SUH-STEC integra el grupo de las microangiopatías trombóticas que afecta con mayor frecuencia a niños menores de 5 años. Es una enfermedad para la cual no existe tratamiento específico y, en los casos más graves, puede derivar en la muerte del paciente. América Latina tiene una situación endémica de casos de SUH-STEC, y la mayoría de ellos suceden en el sur del continente. En Uruguay se estima que ocurren entre 10 y 15 casos de SUH por año, con una tasa de incidencia de 0,5/100.000 habitantes y de 4-5/100.000 niños menores de 5 años. Hasta el momento no se han reportados brotes de origen común y en ningún caso de los estudiados se pudo establecer el/los alimentos implicados. El ganado bovino es reconocido como el principal reservorio de STEC, y el consumo de alimentos derivados contaminados, como una de las principales vías de transmisión a humanos. El contacto directo con animales portadores y su entorno, el contacto persona a persona, el consumo de productos lácteos o derivados, y de frutas y vegetales contaminados son otras fuentes importantes de contagio. La presencia de Escherichia coli productor de toxina Shiga (STEC) en alimentos cárnicos representa un riesgo para la salud pública, sobre todos en países como el nuestro, donde el consumo de carne es uno de los más altos del mundo; y al mismo tiempo genera pérdidas económicas en esta cadena productiva por rechazos fundamentados en la presencia de stx o STEC en productos cárnicos exportados a mercados exigentes. Varios factores de virulencia han sido descritos para estas bacterias, pero no se conocen cuáles son las características que definen con certeza a una cepa STEC con capacidad de producir enfermedad grave. El mecanismo de patogenicidad común, que juega un papel esencial en el desarrollo de SUH-STEC, y que define a este patotipo diarrogénico, es la producción de toxina Shiga (Stx). Diversos subtipos de Stx han sido descriptos y asociados a distintos riesgos de desarrollar enfermedades, siendo el Stx2a el mayormente asociado a casos de SUH-STEC. La adhesión al epitelio intestinal también ha sido reconocida como un factor muy importante en la patogenia de estas bacterias, siendo clásicamente vinculada a la presencia y expresión del gen eae. Se han identificado más de 1200 serotipos de STEC y alrededor de 100 han sido asociados a enfermedad en humanos. Si bien se considera al serotipo O157:H7 stx+/eae+ como el más involucrado en brotes a nivel mundial, en la actualidad existen muchos casos de SUH causados por cepas de otros serotipos y con otros perfiles de virulencia (stx+/eae-). La distribución de estos serotipos es variable y depende de la región o país estudiado. Esta situación pone de manifiesto la necesidad de avanzar en el análisis y la determinación del potencial virulento de las cepas STEC locales, sobre todo aquellas recuperadas de animales utilizados para el abasto o de alimentos derivados de este origen. Los objetivos de la tesis fueron aportar al conocimiento local sobre la prevalencia de genes stx y STEC en carcasas bovinas listas para entrar en la línea de producción y conocer sus variaciones en función del tipo de animal faenado, tipo de frigorífico, época de la faena, aplicación de intervención y tipo de faena. Tanalizada pertenecía al Secuenciotipo (ST) 11. Treinta y ocho aislamientos pertenecieron al tipo B1 de Clermont, mientras que el O157:H7 se clasificó como E. Las STEC analizadas mostraron una alta diversidad genómica y contenían varios determinantes genéticos asociados con la virulencia, lo que subraya el importante papel de WGS para alcanzar una tipificación más completa. También se comparó entre los distintos aislados, las secuencias plasmídicas y de profagos presentes en el genoma. Al mismo tiempo, se identificaron los genes comunes a todos los aislados y los únicos en algunas cepas, determinando así el pangenoma del conjunto de cepas estudiadas. El análisis filogenético mediante WGS permitió determinar la relación entre los aislamientos, observándose agrupamientos en los árboles filogenéticos realizados (cgMLST y SNP) en función del serotipo y secuenciotipo. En este trabajo, no detectamos STEC no-O157 de los serogrupos (O26, O111, O145) previamente aislados de casos locales de SUH. Sin embargo, al interpretar estos hallazgos, se debe tener en cuenta el bajo número de aislamientos analizados y limitaciones metodológicas, así como algún sesgo en la selección de colonias realizada para conservar y estudiar. Los datos obtenidos sugieren que el ganado bovino constituye un reservorio local de serotipos STEC no-O157, incluyendo algunos asociados con enfermedades graves en seres humanos. Se necesitan otros estudios que incluyan más etapas de la cadena cárnica para evaluar de manera global su papel real en la propagación local de STEC. ambién se estudiaron las características microbiológicas de un conjunto de cepas presentes en esta etapa de la cadena de producción de carne bovina, generando información sobre los serotipos STEC circulantes en el momento del estudio, su perfil de virulencia, genes de resistencia y así, poder estimar su potencial patogenicidad. En este trabajo se seleccionó para la toma de muestras la última etapa limpia del proceso de la faena para obtener carne bovina para consumo humano. Para esto, se analizaron 800 muestras de medias canales ubicadas en cámara de maduración y obtenidas en 37 establecimientos de todo del país, y se aislaron cultivos stx+ para su posterior caracterización. Las muestras fueron analizadas por PCR real time, y aquellas muestras stx+ se sembraron en medios sólidos en placa con el objetivo de aislar cepas de Escherichia coli positivas para los genes stx1 y/o stx2, para luego ser conservadas y caracterizadas. La prevalencia de genes stx (solos o asociados a eae) fue del 22,3% (IC95 19,5%-25,3%, n=179), mientras que la prevalencia de STEC fue del 11,3 % (IC95 9,3%-13,7%, n=90) (tomando como STEC positivas aquellas muestras donde se logró obtener al menos una colonia viable, indol positiva y con genes stx). Solo en 2 de las 800 muestras (0,25%, IC 95 0%-0,6%) se logró recuperar Escherichia coli O157:H7, ambas muestras pertenecientes al mismo establecimiento, en la misma fecha de muestreo y provenientes de medias canales distintas. A la hora de analizar los resultados de prevalencia de stx en función de las variables de muestreo, se realizaron pruebas de Chi2, test exacto de Fisher y regresión logística. Se determinó que época del sacrificio, tipo de faena y alimentación animal previa no están asociadas con la prevalencia de genes stx. La categoría animal, establecimiento de faena y presencia de pelos visibles se asociaron con mayor prevalencia de genes stx. En novillos y vaquillonas la prevalencia fue mayor que en el resto, representando un 43% y 34,4%, respectivamente. En frigoríficos de abasto la prevalencia de stx fue 6.7 veces mayor que en exportadores. El análisis multivariado mostró que las variables que inciden significativamente sobre la positividad para genes stx fueron: tipo de frigorífico (abasto), tipo de animal (vaquillona) y presencia de pelos visibles. Para caracterizar las cepas de STEC se utilizaron procedimientos microbiológicos clásicos, secuenciación completa del genoma (“Whole Genome Sequencing” - WGS) y criterios de riesgo de la FAO/OMS. Teniendo en cuenta los costos de la WGS se seleccionaron 50 de las STEC dentro de las 121 muestras con aislamientos recuperados para la caracterización. La selección se realizó de modo aleatorio contemplando cubrir todos los establecimientos positivos en los que se recuperaron cultivos STEC de modo que el muestreo fuese representativo. De las 50 cepas seleccionadas inicialmente, 39 correspondientes a 20 establecimientosfueron confirmadas como STEC por WGS. En este conjunto no detectamos cepas híbridas. Pertenecían a 20 grupos O diferentes y 13 tipos H diferentes. Solo se caracterizó una cepa O157:H7 y, dentro de las no-O157, prevalecieron los serotipos O130:H11 (n = 6), O174:H21/28 (n = 5) y O22:H8 (n = 5). Una cepa mostró resistencia in vitro a la tetraciclina y se detectaron genes de resistencia para doxiciclina, sulfonamida, estreptomicina y fosfomicina. Treinta y tres cepas (84,6%) portaban los genes para los subtipos stx2a, stx2c o stx2d. El gen eae se detectó solo en dos cepas STEC correspondientes a los serotipos O157:H7 (serotipo asociado a casos locales, regionales y mundiales de SUH-STEC) y O182:H25 (ST300). Los genes de virulencia más frecuentes encontrados fueron lpfA (n = 38), ompA (n = 39), ompT (n = 39), iss (n = 38) y terC (n = 39). Dentro del conjunto de STEC analizado, la mayoría (81,5%) pertenecía a los niveles de clasificación de riesgo 4 y 5 (menor riesgo) de la FAO/OMS. Además, se detectaron los serotipos STEC O22:H8, O113:H21, O130:H11 y O174:H21 pertenecientes al nivel de riesgo 2 asociados a diarrea, colitis hemorrágica o SUH. La única cepa O157:H7
Description: El proyecto de doctorado fue aprobado por el Programa de Investigación Biomédica (Pro.In.Bio) en el año 2018. La investigación llevada adelante en este doctorado se enmarca en el proyecto “Prevalencia de Escherichia coli productor de toxina Shiga (STEC) en canales bovinas uruguayas. Distribución de serotipos, pulsotipos y presencia de genes asociados a virulencia en las cepas recuperadas” financiado por el Fondo Sectorial Innovagro - Inocuidad (convocatoria 2017) de la Agencia Nacional de Investigación e Innovación. El proyecto incluyó una beca de doctorado ANII y para su culminación se contó con una beca de finalización de la Comisión Académica de Posgrado (CAP).
Publisher: Udelar. FM
Citation: Mussio Forteza P. Caracterización de Escherichia coli productoras de toxina Shiga (STEC) recuperadas de canales bovinas uruguayas [en línea]. Tesis de Doctorado. Montevideo: Udelar.FM, 2023. 172 p.
License: Licencia Creative Commons Atribución - No Comercial - Sin Derivadas (CC - By-NC-ND 4.0)
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