Puesta a punto de técnicas moleculares para el estudio de nematodos gastrointestinales resistentes a los antihelmínticos en bovinos en sistemas extensivos, en Uruguay

Abstract

En los últimos años ha comenzado a ser una preocupación la falta de eficacia de algunas drogas, en Uruguay la resistencia a las drogas antihelmínticas (RA) es un fenómeno menos estudiado que en ovinos. Este trabajo tuvo como objetivo estudiar la prevalencia de la RA en los nematodos gastrointestinales (NGI) en rodeos de cría en Uruguay. Adicionalmente, se determinó poner a punto los protocolos de PCR disponibles en la literatura para la tipificación de aquellos NGI participantes en la resistencia. La RA fue estudiada utilizando el test in vivo de reducción del conteo de huevos (RCH) de NGI en materias fecales en 37 establecimientos de cría vacuna. Las drogas estudiadas fueron: Ivermectina (IVM, 0.2mg/kg peso vivo), Levamisol (LEV, 10.0mg/kg peso vivo), Ricobendazol (RBZ, 3.75mg/kg peso vivo) y Fenbendazol (FBZ, 5mg/kg peso vivo). La selección de los establecimientos fue realizada por conveniencia basado principalmente en el número de terneros y carga parasitaria. En cada establecimiento. Al día “0”, se seleccionaron 75 animales que fueron asignados al azar a cada uno de los grupos de tratamientos (T) y al control (C). Luego, se tomaron muestras individuales de materia fecal del recto y se aplicó el tratamiento correspondiente. Al día “14” se volvió a tomar muestras. Se definió RA presente cuando él % RCH fue <95%. El mismo se estimó mediante la fórmula: [1-((T14/T0) / (C0/C14))]*100. En cada establecimiento y para cada grupo tratamiento y el control, se realizó un coprocultivo con un pool de las muestras del grupo. Las larvas 3 (L3) obtenidas fueron clasificadas morfológicamente y almacenadas para luego extraer ADN de una alícuota al azar de L3 para los trabajos moleculares. Los PCR fueron realizados en forma única utilizando los cebadores descriptos en la literatura dirigidos a la región del ITS 2 (por su sigla en inglés, internal transcript spacer, espaciador transcrito interno) the Internal Transcribed Spacer 2 (ITS 2) de Haemonchus sp., Cooperia oncophora, Ostertagia ostertagi y Trichostrongylus spp. La resistencia antihelmíntica fue detectada en 100%, 29,7%, 27,0% y 9,7.0% de los estabelecimientos para IVM, LEV, RBZ y FBZ, respectivamente. Del ADN extraído de 94 coprocultivos de un total de 20 establecimientos, en 82,3% (n=78) se obtuvo un amplicón de 226pb correspondiente a lo esperado para Haemonchus spp. En el 88,3% (n=78) de las muestras se obtuvieron amplicones de 106pb definidos para Trichostrongylus spp; en 46,8% (n=44) se identificaron amplicones de entre 192pb y 200pb esperados para Cooperia oncophora y en un 13,8% (n=13) amplicones de 124pb esperados para Ostertagia ostertagi.La prueba estadística de Cohen´s kappa mostró un acuerdo general aceptable (k=0.22, p<0.01) entre la clasificación morfológica y el PCR. Al discriminar por parásito, el estadístico kappa mostró acuerdo aceptable para Haemonchus sp (k=0.30; p<0.01), acuerdo leve para Ostertagia ostertagi (k=0.17) y Cooperia oncophora (k=0.085, p=0.10) y un acuerdo pobre para Trichostrongylus spp (k= -0.14) Estos resultados muestran que la RA está ampliamente difundida en los establecimientos de cría vacuna y los métodos de control químico deben complementarse con alternativas más sustentables. Los protocolos de PCR utilizados acá, mostraron ser eficaces en identificar a los géneros/especies parasitarios para los cuales fueron diseñados sin haberse detectado reacciones cruzadas al usar infestaciones mixtas. De todos modos, más estudios son necesarios para mejorar la clasificación a nivel de especie parasitaria y el acuerdo entre clasificaciones morfológicas y moleculares.