Síntesis y caracterización de nanopartículas de oro bioconjugadas para aplicaciones bioanalíticas

Abstract

Las nanopartículas de oro posiblemente sean una de las nanoestructuras con más uso a lo largo de la historia. Esto es en gran parte se debe a su ruta de síntesis sencilla, y a sus propiedades fisicoquímicas particulares donde se destaca su gran capacidad de absorción de luz y los cambios espectrales que surgen de la variación del tamaño y estado de agregación. Esto es particularmente usado en sensores de tipo colorimétrico e inmunocromatográfico, donde el evento de reconocimiento tiene lugar a través de alguna molécula inmovilizada en la superficie de la AuNP. Cuando esta molécula es de naturaleza biológica hablamos de bioconjugación y de biosensores. En este trabajo se exploró la inmovilización de diferentes proteínas (anticuerpos, BSA, estreptavidina y proteína A/G) sobre la superficie de AuNPs, y al mismo tiempo cada uno de los bioconjugados fue interrogado por diferentes técnicas experimentales a fin de evaluar la calidad del bioconjugado obtenido y las propiedades del sistema coloidal resultante. Entre las técnicas comúnmente empleadas en nanoquímica se destacaron por la contundencia de la información obtenida la espectrofotometría, microscopía electrónica de transmisión (TEM), dispersión dinámica de luz (DLS), potencial Z, estudio de la estabilidad coloidal y espectroscopía Raman aumentada por superficie (SERS). Al mismo tiempo ensayos de movilidad electroforética, exclusión molecular (SEC) o voltamperometría cíclica se destacaron también por su utilidad en la evaluación de protocolos de bioconjugación. De los conjugados más estables obtenidos se destacaron las AuNPs conjugadas a proteína A/G, las cuales fueron empleadas exitosamente en un inmunoensayo mediante TEM para detección de vesículas extracelulares (EVs).Además de posibilitar la detección de EVs, el inmunoensayo permitió caracterizar el nivel de expresión relativo de dos marcadores de superficie (tetraspaninas CD9 y CD81) de las EVs, obteniéndose resultados similares a técnicas ortogonales como la citometría de flujo y ExoView. Por último, se evaluó la inmovilización de una proteína ingenierizada (SpyCatcher) modificada con una cisteína terminal, de cara a permitir su anclaje covalente vía formación de un enlace S-Au. Los conjugados AuNP-SpyCatcher pueden ser empleados a futuro como sistema de inmovilización covalente de proteínas que incorporen la secuencia SpyTag que se une de forma específica a SpyCatcher. Con las técnicas de caracterización optimizadas en este trabajo se obtuvo evidencia de la inmovilización de SpyCatcher sobre AuNPs, y de su capacidad de unión a una proteína conteniendo la secuencia SpyTag. Sin embargo, no fue posible obtener evidencia contundente de que la unión se realizara vía tiol de la cisteína, aunque se presentan ensayos preliminares que apuntan en dicha dirección.