Análisis de ácidos grasos nitrados en leche bovina

Abstract

Los ácidos grasos nitrados (NO2 -FAs) son productos de oxidación formados de la reacción entre los ácidos grasos (FA) insaturados y especies reactivas del nitrógeno, por ejemplo dióxido de nitrógeno ( •NO2 ), derivados del metabolismo celular o de procesos como la inflamación. Los NO2 -FAs, principalmente los nitroalquenos, son compuestos electrofílicos que median acciones de señalización complejas con efectos fisiológicos citoprotectores, antiinflamatorios y metabólicos. En los mamíferos, los niveles endógenos de NO2 -FAs se encuentran en sangre y tejidos a concentraciones nanomolares. Sin embargo, actualmente se desconoce si la leche bovina, fuente alimenticia relevante de ácidos grasos poliinsaturados, también contiene endógenamente NO2 -FAs electrofílicos. La hipótesis del presente trabajo se basa en que la leche vacuna contiene concentraciones micromolares de ácido nitrolinoleico conjugado (NO2 -cLA). La hipótesis se postula dada la presencia de una alta concentración relativa de ácido linoleico conjugado (cLA) en la leche vacuna, el cual es reconocido como uno de los principales ácidos grasos endógenos susceptibles de reaccionar con especies reactivas del nitrógeno, tanto in vitro como in vivo, generando NO2 -cLA. El objetivo general de esta tesis de maestría fue aplicar técnicas analíticas basadas en diferentes y sucesivos métodos de extracción lipídica y espectrometría de masas, para demostrar formalmente que la leche bovina contiene endógenamente ácido nitro-linoleico conjugado (NO2 -cLA). Se utilizaron muestras de leche obtenidas por la Facultad de Agronomía (Paysandú, Plataforma EEMAC) e INIA-La Estanzuela 3 (Colonia; Plataforma LE) en forma controlada y estandarizada. Se analizaron muestras de animales de diferentes razas y en diferentes estados metabólicos de acuerdo al período de lactancia de los animales.Las muestras de leche fueron procesadas para extraer ácidos grasos utilizando 15NO2 -cLA y NO2 -SA como estándares internos. El análisis cuantitativo se realizó en un espectrómetro de masa QTRAP 4500 y los softwares Analyst 1.6.1, MultiQuant, LipidViewer y GraphPad 8.0. Los resultados obtenidos permitieron detectar NO2 -cLA en la leche de este grupo de animales en el rango de 0.013-1.6 mg/L correspondiente a 0.4-4.8 μM. El análisis comparativo de cLA y de NO2 -cLA en muestras individuales de leche permitió establecer que hasta el 2.7% del cLA lácteo se encuentra nitrado. Sin embargo, mientras que más del 97% de cLA estaba esterificado en forma de triglicéridos y fosfolípidos, la gran mayoría del NO2 -cLA se encontró como ácidos grasos libres no esterificados. Este resultado sugiere que la incorporación enzimática de NO2 -cLA a triglicéridos y fosfolípidos no es óptima y apoya la hipótesis de que el NO2 -cLA lácteo se podría estar formando en el tracto digestivo, en particular en los compartimentos ácidos. Los niveles de NO2 -cLA en la leche bovina variaron significativamente con el período de lactancia para diferentes genéticas bovinas NZ y USA, en algunos casos con niveles más altos al comienzo de la lactancia. Para confirmar que el NO2 -cLA detectado en la leche por MS correspondía a un ácido graso nitrado electrofílico, se realizó un ensayo de reactividad con el nucleófilo β-mercaptoetanol (BME). De esta manera se demostró la formación de aductos reversibles covalentes que confirman el NO2 -cLA como nitroalqueno. En condiciones gástricas ácidas en presencia de nitrito (NO2 - ), se produjo un aumento significativo en los niveles de NO2 -cLA, lo que sugiere que el NO2 -cLA de la leche puede originarse, al menos en parte, a partir de nitración de cLA en el tracto digestivo.En resumen, mostramos por primera vez que la leche contiene concentraciones micromolares de NO2 -cLA endógeno. Teniendo en cuenta que en concentraciones micromolares el NO2 -cLA es capaz de modular a nivel fisiológico la expresión génica antiinflamatoria y las respuestas metabólicas, nuestro hallazgo de NO2 -cLA presente endógenamente en la leche vacuna convierte a este ácido graso en un nutriente funcional de potencial importancia para la salud humana.