Ingeniería de proteínas para la síntesis de aminas quirales: optimización de una ω-transaminasa de Capronia semiimmersa

Abstract

Las enzimas son catalizadores eficientes y sustentables, capaces de llevar a cabo reacciones tanto quimio- como estereoespecíficas difíciles de lograr mediante métodos químicos tradicionales. La biocatálisis se alinea con los principios de la química verde, lo que redunda en ventajas tanto desde el punto de vista ambiental como económico. Un área en la que presenta un gran potencial es la síntesis de aminas quirales. Estas se encuentran presentes en un alto porcentaje de fármacos y compuestos bioactivos, por lo que su producción es un objetivo fundamental para la industria. Su síntesis química tradicional en forma enantioméricamente pura es difícil de lograr, requiriendo catalizadores que utilizan metales pesados y por lo tanto generan alto impacto ambiental. Enzimas como imino-reductasas, aminasas reductivas o transaminasas podrían proveer un proceso mejor para este fin, pero se hace necesaria la búsqueda de enzimas de este tipo que sean capaces de cumplir con los exigentes requisitos de los procesos industriales. En trabajos previos del grupo fue identificada y caracterizada una ω-transaminasa de Capronia semiimmersa (TACap). Esta enzima demostró ser capaz de utilizar tanto D-alanina como isopropilamina como donores de amino, siendo esta última más atractiva desde un punto de vista económico. La producción y purificación de la enzima fueron optimizadas y la especificidad de sustrato ensayada. En particular se destaca la capacidad de esta enzima de tomar como sustrato aceptor de amino a la fenilacetona, dando como producto a la L anfetamina. Este producto es intermediario en la síntesis del [11C]L-deuterodeprenil, un radiofármaco de utilidad en el diagnóstico de enfermedades neurodegenerativas de uso actualmente en el Centro Uruguayo de Imagenología Molecular.Si bien esto resultó promisorio, el grupo se encontró con bajas conversiones debido a una baja estabilidad de la enzima en las condiciones de reacción. Este trabajo de maestría se planteó aprovechar el avance de los métodos bioinformáticos y de la química computacional para desarrollar, a partir de esta enzima ya caracterizada, variantes que permitiesen cumplir con los requisitos de actividad y estabilidad requeridos para el escalado de la reacción mencionada anteriormente. Partiendo de esta premisa fue recreada una estructura tridimensional de TACap, cuya dinámica molecular fue simulada y analizada para comprender las interacciones moleculares presentes y proponer modificaciones que pudiesen aumentar su estabilidad. Mediante esta estrategia se propuso la eliminación de dos regiones desordenadas. En paralelo fue seguida una estrategia basada en el análisis de la secuencia: fue construida una secuencia consenso utilizando 919 secuencias relacionadas a la TACap. Se ha reportado que los aminoácidos conservados pueden contribuir favorablemente a la estabilidad, por lo que se seleccionó un conjunto de 41 mutaciones puntuales (aminoácido nativo intercambiado por aminoácido consenso) con potencial para estabilizar la proteína. xi Las modificaciones propuestas fueron incorporadas sobre el gen codificante de la enzima nativa mediante PCR, y las variantes fueron expresadas para analizar su estabilidad y actividad. La estabilidad fue evaluada mediante la medida de la temperatura de melting (desnaturalización) aparente (Tm) de las proteínas, y aquellas con un Tm superior a aquel de la enzima nativa fueron evaluadas en cuanto a su actividad. La prueba de actividad fue llevada a cabo mediante un ensayo espectrofotométrico con un sustrato modelo, y aquellas enzimas con una actividad comparable o superior a la de la enzima nativa fueron consideradas para el siguiente paso.Las tres mejores variantes fueron combinadas para dar lugar a cuatro enzimas que fueron nuevamente evaluadas en cuanto a su estabilidad y actividad. Una de estas variantes, conteniendo las mutaciones L106V y Δ211-217, presentó un aumento en la Tm de 6°C, junto con una actividad relativa de 213% comparada con la enzima original, lo que la vuelve una opción muy prometedora para su aplicación a la síntesis del radiofármaco de interés.