Biocatálisis aplicada a la síntesis de radiotrazadores: síntesis de S-adenosil metionina por metodologías biocatalíticas.

Abstract

En la naturaleza, la mayoría de las biomoléculas y productos naturales contienen algún centro quiral, siendo este fundamental en relación con su actividad biológica. Esta situación se repite a la hora del diseño de fármacos, existiendo un interés creciente en desarrollar procesos capaces de producir fármacos ópticamente puros, dado que la administración de una mezcla de isómeros puede acarrear problemas sanitarios y/o pérdidas económicas. Este trabajo busca ofrecer una alternativa enzimática para la síntesis del radiotrazador [ 11C](S,S)-S-adenosilmetionina ([ 11C]SAM), de potencial aplicación en el seguimiento mediante PET-CT de tumores de próstata particularmente agresivos. La principal ventaja de la estrategia biocatalítica planteada radica en que permitiría obtener el producto al menos en forma diasteroméricamente pura, lo cual, además de mejorar los rendimientos de la síntesis significa mejor sensibilidad para el diagnóstico y mayor seguridad clínica al administrarlo al paciente. Además, si se emplea un derivado enzimático inmovilizado, se simplifican las etapas de purificación del producto en un iv proceso donde el tiempo es una variable fundamental, agregando la posibilidad de reutilización del catalizador. En trabajos previos se han abordado de forma independiente tanto la expresión heteróloga de la enzima responsable de la síntesis de SAM, denominada Metionina Adenosiltransferasa (MAT), como la radiosíntesis enzimática de [11C]SAM; esto último utilizando un extracto crudo de hígado de rata que contiene a MAT, no existiendo hasta el momento una síntesis biocatalítica de [11C]SAM con enzima aislada.Estos antecedentes sumados a los avances actuales en cuanto a la expresión heteróloga de enzimas, el desarrollo de biocatalizadores inmovilizados y la existencia de módulos automatizados para radiosíntesis (GE Tracerlab – General Electric), que este grupo consideró potencialmente adaptables a la síntesis enzimática, permitieron postular que la radiosíntesis en un módulo automatizado de [11C]SAM a partir de [11C]L-Metionina y ATP, utilizando la enzima aislada, en forma soluble o inmovilizada en fase sólida, era viable. En el marco de esta tesis se logró desarrollar biocatalizadores adecuados para la aplicación propuesta. En primer término, se clonó y expresó en E. coli una mutante de la metionina adenosiltransferasa (MAT), MATI303V, con mayor actividad en la síntesis de SAM. Esta enzima fue sometida a un proceso de purificación que resultó exitoso, obteniendo un rendimiento de 155 mg de proteína soluble por litro de cultivo. El desarrollo de un ensayo de actividad permitió comprobar que la enzima expresada era activa para la síntesis de SAM y evaluar parámetros cinéticos y de estabilidad. Posteriormente, se desarrolló un derivado inmovilizado de la enzima mediante una química de unión covalente irreversible (enlace tipo isourea), utilizando como soporte agarosa, obteniendo un rendimiento de inmovilización en proteínas del 71% y un 100% de actividad expresada en el derivado, lo que indica que toda la enzima fue inmovilizada en su conformación activa. Ambos biocatalizadores, enzima soluble e inmovilizada, fueron utilizados para sintetizar v [ 11C]SAM en un módulo automatizado, a partir de [11C]L-Metionina.La metionina marcada fue sintetizada in situ a partir de [11C]CH3I y L-homocisteina tiolactona, mediante un proceso previamente estandarizado en CUDIM. La [11C]SAM fue obtenida en tiempos cortos (5 a 10 minutos), con un exceso diasteromérico y enantiomérico > 99% y altos rendimientos (~80%), tanto para el biocatalizador soluble como para el derivado inmovilizado. Además, se verificó que el derivado enzimático inmovilizado puede ser utilizado en varios ciclos de reuso sin perder actividad y manteniendo los rendimientos de radiosíntesis en valores aceptables para la aplicación buscada, aportando a la economía del proceso.