Puesta a punto de una técnica de PCR Multiplex para el diagnóstico de la resitencia de Haematobia irritans a insecticidas

Abstract

Haematobia irritans es un díptero parásito de los bovinos en pastoreo que ocasiona principalmente intranquilidad. En Uruguay, su control se basa en el uso de insecticidas habiéndose diagnosticado resistencia a piretroides sintéticos a pocos años de su ingreso al país, estando actualmente ampliamente distribuida por el país. En virtud de que se han comenzado a usar otros productos insecticidas, es importante identificar mutaciones relacionadas a resistencia que permitan monitorear las estrategias de control y desarrollar técnicas moleculares que permitan hacer un diagnóstico simultáneo a las mismas. La resistencia tipo kdr en poblaciones resistentes a cipermetrina, fue demostrada previamente en el país, pero hasta el momento no se ha estudiado la presencia de mutación rdl, asociada a resistencia a ciclodienos y posiblemente asociada a fipronil. Este trabajo tuvo como objetivos poner a punto la Reacción en cadena de la Polimerasa Multiplex (PCR Multiplex) que permita detectar simultáneamente en un mismo individuo, las mutaciones a cipermetrina y a fipronil y comprobar que los individuos que se mostraron resistentes en los bioensayos poseen la mutación genética que les confiere la resistencia. Dicho ensayo se realizó en el período de marzo 2016 a junio 2017. Se escogieron 11 establecimientos, de los cuales 9 presentaron resistencia fenotípica a fipronil y 2 eran susceptibles, para cipermetrina también 9 presentaron resistencia fenotípica y 2 eran susceptibles al principio activo. Se extrajo DNA de esas poblaciones con un kit comercial de extracción y también con la técnica de fenol cloroformo. Para evitar interferencia entre la carga genética de moscas machos en moscas hembras, el DNA se extrajo sólo de las cabezas de 15 machos y de 15 hembras de Haematobia irritans, por población. Posteriormente se puso a punto una PCR multiplex, alelo específico, en base a protocolos descritos por otros autores, para la mutación kdr y para la mutación rdl descrita para endosulfan. La puesta a punto comprendió el estudio de diferentes temperaturas de anidamiento para los primes escogidos, concentración de reactivos, y ciclos.Todas las poblaciones resistentes a cipermetrina presentaron resistencia tipo kdr, principalmente en la forma de heterocigosis. Ninguna de las poblaciones resistentes a fipronil, presentó la mutación descrita para endosulfan, tal vez porque la resistencia este en una etapa incipiente o porque dicha mutación no es la responsable de la resistencia, pudiendo estar localizada en otro punto del GABA-Cl o porque la resistencia en esas poblaciones sea de origen metabólico. Se presenta el protocolo optimizado de esta técnica multiplex alelo específica. En conclusión, la resistencia tipo kdr está ampliamente distribuida en todo el país, y el proceso de selección para resistencia se encuentra aún en la etapa de meseta para la mayoría de las poblaciones estudiadas. Se llama la atención a que en una población se comenzó a detectar individuos homocigotos resistentes, aumentando las probabilidades de no reversión de la resistencia. Se sugiere seguir secuenciando fragmentos del GABA-Cl para identificar las mutaciones a fipronil.