Desarrollo de un promotor resistente al silenciamiento génico e inducible para la producción de anticuerpos recombinantes en células de ovario de hamster chino

Abstract

La producción de anticuerpos recombinantes es una de las áreas más importantes en la industria biofarmacéutica siendo el promotor de la transcripción de citomegalovirus (promotor CMV) el más utilizado para expresarlos en líneas celulares de mamíferos y su uso radica en que es un promotor fuerte. Sin embargo, este promotor es susceptible de ser silenciado, lo que limita la productividad de proteínas recombinantes. Algunas islas CpG pueden evitar el silenciamiento genético de los genes de expresión constitutiva (housekeeping), por esa razón se han utilizado para disminuir el silenciamiento de los genes recombinantes en células de origen animal. En este trabajo se analizó la utilidad de la isla CpG de la región promotora del gen de β actina (ACTB) de Cricetulus griseous para reducción del silenciamiento del promotor CMV y generar un nuevo promotor más resistente al silenciamiento. Para ello, utilizamos la región no codificante de la isla CpG, a la que denominamos RegCG, observando mediante ensayos de transcripción transientes y estables que se comporta como un promotor en células CHO-K1, siendo más resistente al silenciamiento que el promotor CMV. También, se comprobó que la que combinación RegCG y CMV para formar promotores híbridos genera promotores más resistentes al silenciamiento que los promotores CMV y RegCG por separado, pudiendo mantener la expresión de anticuerpos recombinantes en clones estables luego de 40 días de cultivo sin presión selectiva a un nivel promedio 4 veces más alto que el promotor de CMV. Este promotor híbrido demostró ser compatible con el sistema de amplificación genética por inducción con metotrexato en células de ovario de Hámster chino (CHO) deficientes en el gen dihidrofolato reductasa (DHFR), que junto a una estrategia de enriquecimiento de poblaciones productoras basada en FACS permitió obtener clones productores de anticuerpos con productividad específica de 2,7 pg/célula/día en condiciones de cultivo no optimizadas. Adicionalmente, al promotor híbrido se asoció con elementos de respuesta a hormonas esteroidales para probar la capacidad de generar un promotor inducible a partir del promotor CMV. La adición de un tándem de elementos de respuesta a glucocorticoides (GRE) entre RegCG y CMV resultó en la generación de un promotor que fue capaz de responder a la inducción en presencia de su ligando (dexametasona) en algunos clones de células CHO-K1 que contienen este viii ix promotor, asumiendo que las condiciones de inducción pueden ser variables para cada clon y las que deben ser estudiadas caso a caso. En síntesis, en el contexto de esta tesis se construyó un promotor híbrido entre RegCG, un tándem de GREs y CMV que permitió obtener clones productores de anticuerpos recombinantes con menor silenciamiento transcripcional que el promotor CMV y obtener clones de alta producción de anticuerpo demostrando que este promotor podría ser una buena alternativa para la generación de clones para aplicaciones industriales. Este trabajo conto con el financiamiento de los proyectos Anillo ACT-210068 y Fondecyt regular 1221031de la Agencia Nacional de Investigación y Desarrollo (ANID), Chile.