Diarrea viral bovina : desarrollo de nueva herramienta diagnóstica y avances en la epidemiología molecular del virus en Uruguay

Abstract

La Diarrea Viral Bovina (DVB) es una enfermedad viral con un gran impacto negativo en la producción y reproducción del ganado bovino. Luego de la Fiebre aftosa, este es el virus que causa las pérdidas económicas más importantes en la producción bovina. El agente etiológico es un Pestivirus de la Familia Flaviviridae. Está distribuida ampliamente a nivel mundial con gran diseminación en los rebaños bovinos en la región, y la prevalencia oscila entre un 60 – 85%. Una característica relevante es la capacidad de producir animales inmunotolerantes (persistentemente infectados - PI) que muchas veces pasan desapercibidos y eliminan gran cantidad de virus al rodeo, siendo estos la primer y principal fuente de transmisión viral. Desde el punto de vista diagnóstico, lograr detectar al virus tempranamente en un rodeo permite establecer un programa de control más eficiente, ya que la aplicación de vacunas como principal medida de control está demostrado que no es suficiente en predios con animales PI. El objetivo de este trabajo de maestría fue por lo tanto comparar técnicas moleculares tradicionales (PCR convencional y Real time PCR) con una de última generación (Droplet Digital PCR – ddPCR), que ha demostrado presentar ventajas importantes sobre las primeras. Para esto, se utilizaron dos tipos de muestras (suero y leche contaminada artificialmente) de animales con diagnóstico previo de DVB por PCR convencional. Por otro lado, se analizaron las secuencias genéticas de los virus identificados, con el objetivo de contribuir al conocimiento de la variabilidad genética de DVB circulantes en el país. La ddPCR demostró tener mayor sensibilidad y precisión para la detección y cuantificación de DVB. El límite de detección de la técnica ddPCR utilizando la cepa de referencia NADL fue hasta 0,24 copias/μl en la dilución -6 (286,3 x 10-6 ng/μl) logrando detectar un orden más que las técnicas preexistentes. Los resultados demuestran que Droplet Digital PCR es una herramienta robusta para detectar el virus más precozmente en los rodeos, ya sea a nivel individual y de animales PI o en muestras colectivas de leche. Por otro parte, los resultados del análisis de las secuencias analizadas en este trabajo de tesis, fueron un total de 32, de las cuales 30 (94%) tienen mayor porcentaje de verosimiltud a las secuencias VDVB-1 y 2 (6%) a las secuencias de VDVB-2.