Estudio de la reacción de la hemoperoxidasa híbrida tipo A de Trypanosoma cruzi (APx-CcP) con peroxinitrito in vitro e in vivo

Abstract

Trypanosoma cruzi, agente causal de la enfermedad de Chagas, es un parásito intracelular obligado capaz de invadir y proliferar en células de mamíferos. Para establecer la infección, el parásito debe sobrevivir al ataque nitro-oxidativo del macrófago en respuesta a la invasión (generación de superóxido (O2 •- ), peróxido de hidrógeno (H2O2) y peroxinitrito (ONOOH/ONOO- )). Dentro de las enzimas antioxidantes de T. cruzi, se encuentra una hemoperoxidasa (APx-CcP) que incrementa la infectividad parasitaria tanto in vitro como in vivo. Se trata de una peroxidasa híbrida, que reduce H2O2 utilizando ascorbato o citocromo c como sustrato reductor. Motivados por la reactividad de otras hemoperoxidasas con peroxinitrito y dado que la enzima se localiza en la membrana plasmática en las formas infectivas, nos propusimos estudiar la reacción de la APx-CcP con peroxinitrito y su rol en la detoxificación de este oxidante en la infección a macrófagos. Mediante métodos de cinética rápida y de competencia, determinamos que la enzima reacciona rápidamente con el peroxinitrito (k = 3-4 x 106 M-1s -1 , pH 7.4 y 25°C) mediante la formación de un compuesto tipo I (FeIV=O,Trp•+) que detectamos por análisis espectroscópico y experimentos de inmunospin trapping con DMPO. Finalmente evidenciamos que parásitos sobreexpresantes de APx-CcP son más infectivos que los WT en macrófagos inmunoestimulados (IFN-γ/LPS) y que la sobreexpresión de la enzima resulta en una menor detección del oxidante en el macrófago durante la invasión (citometría de flujo, sonda fluoresceína boronato). Los resultados obtenidos en este trabajo indican que la APx-CcP reacciona con el peroxinitrito protegiendo al parásito de sus efectos citotóxicos.