english Icono del idioma   español Icono del idioma  

Please use this identifier to cite or link to this item: https://hdl.handle.net/20.500.12008/33538 How cite
Title: Mecanismos bioquímicos de la nitración de tirosinas en membranas: estudios con peroxinitrito y otros sistemas oxidantes
Authors: Bartesaghi Hierro, Silvina
Obtained title: Doctor en Química
University or service that grants the title: Universidad de la República (Uruguay). Facultad de Química
Tutor: Radi, Rafael
Type: Tesis de doctorado
Descriptors: PROTEINAS TIROSINA QUINASAS RECEPTORAS, MEMBRANAS, ACIDO PEROXINITROSO, OXIDANTES, DIMERIZACION, PEROXIDOS LIPIDICOS, CONSUMO DE OXIGENO
Issue Date: 2010
Content: 1 Resumen 1 -- 2 Introducción 4 -- 2.1 Nitración biológica como modificación oxidativa postraduccional 4 -- 2.1.1 Antecedentes 4 -- 2.1.2 Consecuencias biológicas 6 -- 2.1.3 Aspectos cuantitativos 11 -- 2.2 Especies oxidantes y nitrantes 13 -- 2.2.1 Radical Superóxido 14 -- 2.2.2 Peróxido de Hidrógeno 15 -- 2.2.3 Radical hidroxilo 15 -- 2.2.4 Oxido nítrico 16 -- 2.2.5 Dióxido de nitrógeno 17 -- 2.2.6 Peroxinitrito 18 -- 2.2.7 Radical carbonato 19 -- 2.2.8 Acido hipocloroso y cloruro de nitrilo 20 -- 2.2.9 Integración de las rutas de ROS y RNS 21 -- 2.3 Mecanismos de nitración de tirosinas -- 24 Determinantes fisicoquímicas de la nitración de tirosinas proteicas 27 – 2.4.1 Determinantes fisicoquímicas en entornos acuosos 28 -- 2.4.2 Determinantes fisicoquímicas en entornos hidrofóbicos – 29 2.5 Inhibición y reparación de la nitración de tirosinas: agentes anti-nitrantes endógenos y exógenos 31 -- 2.5.1 Agentes endógenos 31 -- 2.5.1.1 Enzimas antioxidantes 31 – Peroxiredoxinas 31 Glutatión peroxidasa 32 Hemoproteínas 33 -- 2.5.1.2 Moléculas antioxidantes 33 Glutatión Acido Úrico 34 Acido lipoico 35 Reacciones de reparación 35 -- 2.5.2 Agentes exógenos 36 -- 2.5.2.1 Metalo Porfirinas 36 -- 2.5.2.2 Nitróxidos 38 -- 2.5.2.3 Ebselen 40 -- 2.5.2.4 Péptidos de tirosina 40 -- 2.6 Membranas biológicas y sistemas modelo 41 -- 2.6.1 Estructura de las membranas biológicas 41 -- 2.6.2 Sistemas modelo de membranas 45 Artículo: “Simulating Life´s Envelopes” 48 -- 2.7 Permeabilidad y difusión de oxidantes en membranas 49 -- 2.7.1 Permeabilidad de moléculas cargadas 49 -- 2.7.2 Permeabilidad de moléculas neutras 51 -- 2.7.3 Difusión y reparto en fases hidrofóbicas 52 -- 2.8 Lipoperoxidación y otras modificaciones oxidativas en membranas 54 -- 2.8.1 Etapas de la lipoperoxidación y formación de productos 54 -- 2.8.2 El rol del -tocoferol 57 -- 2.8.3 Otros procesos oxidativos en membranas 59 -- 3. Objetivos 61 -- 4. Materiales y Métodos 62 -- 4.1 Materiales 62 -- 4.2 Métodos 63 -- 4.2.1 Síntesis de BTBE y Productos Derivados 63 -- 4.2.2 Síntesis y Purificación de Péptidos Transmembrana 63 -- 4.2.3 Preparación de Liposomas e Incorporación de las Sondas 64 -- 4.2.4 Síntesis y Cuantificación de Peroxinitrito 66 -- 4.2.5 Sistemas Oxidantes 67 -- 4.2.6 Cuantificación de 3-NT y 3-NO2-BTBE por Espectrofotometría 67 -- 4.2.7 Cromatografía Líquida de alta Performance (HPLC) 68 -- 4.2.8 Espectrometría de Masa (MS) 69 -- 4.2.9 Resonancia Paramagnética Electrónica (EPR) 70 -- 4.2.10 Productos de la Lipoperoxidación 71 -- 4.2.11 Estudios Computacionales 72 -- 4.2.12 Estimación de las distancias de difusión del peroxinitrito en suspensiones de liposomas 72 -- 4.2.13 Análisis de los Resultados 73 -- 5. Objetivo # 1. Estudio de los mecanismos de nitración de tirosinas en membranas mediada por peroxinitrito: utilización de la sonda hidrofóbica N-t-BOC-tert-butil ester L- tirosina incorporada a liposomas de fosfatidilcolina 74 -- 5.1 Análisis del BTBE y sus productos de oxidación 3-nitro-BTBE and 3,3´- di BTBE 74 -- 5.2 Hidroxilación del BTBE mediada por peroxinitrito en liposomas de DLPC 77 -- 5.3 Detección del radical fenoxilo derivado del BTBE por EPR 81 -- 5.4 Oxidación del BTBE mediada por peroxinitrito: liposomas saturados e insaturados 83 -- 5.5 Inhibición de la oxidación del BTBE por atrapadores de peroxinitrito y/o radicales derivados 85 -- 5.6 Efecto del CO2 en la oxidación del BTBE 91 -- 5.7 Efecto de complejos metálicos de transición sobre la nitración del BTBE mediada por peroxinitrito 93 -- 5.8 Efecto del pH en la nitración, dimerización e hidroxilación del BTBE 95 -- 5.9 Discusión 98 Publicación: “Mechanistic Studies of Peroxynitrite-Mediated Tyrosine Nitration in Membranes Using the hidrophobic Probe N-t-BOC-L-tyrosine tert-Butyl Ester” -- 107 -- 6. Objetivo # 2 Evaluación de la participación del proceso de lipoperoxidación en la nitración y dimerización de tirosinas en membranas 108 -- 6.1 Participación de los radicales lipídicos en la oxidación del BTBE 108 -- 6.2 Detección de los radicales lipídicos en la oxidación del BTBE por EPR 112 -- 6.3 Lipoperoxidación y oxidación del BTBE mediadas por peroxinitrito: bolo vs infusión lenta 114 -- 6.4 Efecto del grado de insaturación en la oxidación del BTBE mediada por peroxinitrito 117 -- 6.5 Lipoperoxidación inducida por hemina y ABAP 118 -- 6.6 Efecto del -tocoferol en la oxidación del BTBE y en la lipoperoxidación 126 -- 6.7 Consumo de oxígeno y determinación cinética de la reacción entre radicales LOO● y BTBE 127 -- 6.8 Discusión 134 Artículo: “Lipid Peroxyl Radicals Mediate Tyrosine Dimerization and Nitration in Membranes” 141 Artículo: “Tyrosine versus Lipids” 142 -- 7. Objetivo # 3 Síntesis, caracterización y validación de péptidos transmembrana para el estudio de los mecanismos de nitración de tirosinas en membranas 143 -- 7.1 Síntesis de los péptidos 143 -- 7.2 Purificación y caracterización de los péptidos 146 -- 7.3 Formación de NO2-Y8 dependiente de peroxinitrito 149 -- 7.4 Discusión 155 -- 8. Conclusiones y Perspectivas 159 -- 8.1 Conclusiones 159 -- 8.2 Perspectivas 163 -- 9. Referencias 164 -- 10. Publicaciones 184 -- 11. Anexos 192 -- 11.1. Tabla de Abreviaturas 192 -- 12. Agradecimientos 196
Abstract: La nitración de tirosinas es una modificación oxidativa postraduccional que ocurre en proteínas por reacciones del peroxinitrito y otras especies nitrantes derivadas del óxido nítrico. Este proceso está asociado a condiciones de estrés nitro-oxidativo en sistemas biológicos, y puede llevar a alteraciones en la estructura y función de proteínas. Hasta el presente, se han descrito mecanismos bioquímicos de nitración de tirosinas en sistemas acuosos, la mayoría de los cuales implican la participación de radicales libres, incluyendo el radical tirosilo. Sin embargo, un conjunto de proteínas nitradas en residuos de tirosina que han sido detectadas in vivo, están asociadas o incorporadas a biocompartimientos hidrofobicos como biomembranas o lipoproteínas. En este sentido, los mecanismos bioquímicos y determinantes fisico-quimicas que participan en la nitración de tirosinas asociadas a ambientes hidrofobicos pueden tener importantes diferencias con lo estudiado hasta el presente en sistemas acuosos, entre otros factores, porque en entornos hidrofóbicos existe una gran concentración de ácidos grasos insaturados que pueden competir por las especies nitrantes, y una exclusión de antioxidantes como el glutatión, que no se encuentran presentes en membranas y que por lo tanto no actúan inhibiendo la nitración como ocurre en fases acuosas; así como la relevancia de agentes nitrantes como el NO y NO2 que pueden fácilmente difundir hacia estos ambientes hidrofóbicos y concentrarse, favoreciendo las reacciones de nitración. Basado en estas consideraciones, en este trabajo de tesis hemos realizado un estudio exhaustivo de los mecanismos bioquímicos de nitración de tirosinas en sistemas modelo de membrana. Para ello, hemos utilizado sondas hidrofóbicas de tirosina en bicapas artificiales tales como, el análogo de bajo peso molecular BTBE (N-t-BOC tert butil ester L-tirosina) y péptidos hidrofóbicos de tirosina conteniendo 23 amino ácidos que fueron incorporados a liposomas de fosfatidilcolina. Los sistemas nitrantes y oxidantes utilizados en esta tesis fueron el peroxinitrito, un dador de radicales peroxilo, ABAP (2,2 '-azobis (2) amidinopropano cloruro de hidrógeno) e hidroperóxidos en presencia de hemina en ausencia y presencia de nitrito (NO2 -). Los resultados obtenidos indican que la nitración de tirosinas en membranas ocurre por mecanismos radicalares, con la formación intermediaria del radical tirosilo; en el caso del BTBE además de la nitración para formar 3-nitroBTBE, las reacciones con peroxinitrito llevaron a la formación de cantidades menores de el dímero 3,3´di-BTBE y del derivado hidroxilado 3-hidroxi BTBE. Mientras que el rendimiento de nitracion de BTBE en función de la concentración de peroxinitrito fue menor pero en el orden de lo observado en sistemas acuosos, el rendimiento de producto de dimerización fue mucho menor, en linea con una difusión limitada del radical tirosilo en la estructura organizada de la membrana. Por otra parte, la deteccion del derivado hidroxilado apoya el concepto de la homólisis de ONOOH a OH y NO2 en la superficie o en el interior de la bicapa. Se exploró el efecto de una serie de moléculas de relevancia biológica como atrapadores de radicales libres y metales de transición en los rendimientos de nitracion, siendo el resultado más contrastante con lo ocurrido en fases acuosas, el efecto del CO2, el cual inhibió la nitración del BTBE incorporado a liposomas, lo que se explica por la incapacidad del radical carbonato (CO3) de permear la membrana liposomal y oxidar por un electrón a la tirosina incorporada a la membrana. Un hallazgo particularmente importante de la tesis fue la observación que los procesos de nitracion de BTBE ocurrian tanto en liposomas conteniendo fosfolípidos con ácidos grasos saturados (ej. DLPC, 1,2-dilauril-sn-glicero-3-fosfocolina) como insaturados (ej. EYPC, fosfatidilcolina de yema huevo). Dada la alta abundancia de fosfolípidos y su reacción con radicales libres oxidantes para disparar procesos de lipoperoxidacion, exploramos de que manera los radicales lipídicos podrían influir en el proceso de nitracion. Los resultados indicaron que los radicales lipídicos peroxilo (LOO) son capaces de oxidar a la tirosina por un-electron para rendir radical tirosilo, y de esta manera alimentar el proceso de oxidación de tirosinas en membranas. En efecto, se logro la detección simultánea de los radicales tirosilo y lipídicos cuando se adicionó peroxinitrito a liposomas de PC conteniendo fosfolípidos insaturados y con BTBE incorporado. La constante de reaccion determinada para la reaccion entre radicales peroxilo lipídicos y la tirosina fue 4.800 M-1s-1. La conexión entre el proceso de lipoperoxidación y la nitración de tirosina fue confirmada por una serie de experimentos, entre los cuales destacamos la inhibición concomitante de ambos procesos a bajas tensiones de oxigeno y por la incorporación a liposomas de alfa-tocoferol. Finalmente, pudimos sintetizar, purificar y utilizar en un conjunto exploratorio de experimentos a péptidos hidrofóbicos de 23 camino ácidos conteniendo tirosina en distinta posición de la esctructura primaria y que se incorporan a traves de la membrana liposomal. Hemos demostrado la capacidad del peroxinitrito de nitrar los residuos de tirosina de estos péptidos, confirmando los resultados principales obtenidos con BTBE. En suma, esta tesis ha aportado a las bases bioquímicas y mecanísticas de la nitración de tirosina en proteínas asociadas a membranas.
Publisher: Udelar. FQ. PEDECIBA
Citation: Bartesaghi Hierro S. Mecanismos bioquímicos de la nitración de tirosinas en membranas: estudios con peroxinitrito y otros sistemas oxidantes [en línea]. Tesis de Doctorado. Montevideo: Udelar. FQ. PEDECIBA, 2010. 313 p.
License: Licencia Creative Commons Atribución - No Comercial - Sin Derivadas (CC - By-NC-ND 4.0)
Appears in Collections:Tesis de Posgrado - PROINBIO

Files in This Item:
File Description SizeFormat  
TD_Bartesaghi S_2010.pdfMecanismos bioquímicos de la nitración de tirosinas en membranas: estudios con peroxinitrito y otros sistemas oxidantes11,36 MBAdobe PDFView/Open


This item is licensed under a Creative Commons License Creative Commons