Aplicación de la estrategia RIVET para la identificación de genes de Ralstonia solanacearum expresados durante la infección en papa

Abstract

Ralstonia solanacearum es la bacteria responsable de una enfermedad de relevancia mundial, la murchera, que afecta a un amplio rango de cultivos de importancia económica como tomate, papa, berenjena y tabaco. En Uruguay este patógeno impacta, desde hace algunos años, seriamente en la producción de papa, uno de los pricipales cultivos hortícolas. El complejo diálogo patógeno-hospedero implica un primer paso de reconocimiento, interacción del patógeno con el sistema de defensa de la planta, colonización y adaptación al nuevo medio ambiente. Por mucho tiempo, los estudios sobre los mecanismos de patogenicidad se llevaron a cabo por medio de ensayos en condiciones de laboratorio bien definidas. Si bien estos estudios in vitro permitieron muchos avances, los microorganismos coexisten en sistemas complejos y establecen con su hospedero interacciones difíciles de reproducir en el laboratorio. En los últimos años se diseñaron nuevas estrategias con el objetivo de detectar genes de virulencia de la bacteria in vivo. Un ejemplo ha sido la técnica de RIVET (Recombinase-based In Vivo Expression Technology) que permite detectar promotores del patógeno que son activados débil o transitoriamente durante el proceso de infección. El objetivo planteado en esta tesis es la identificación genes de R. solanacearum raza 3, biovar 2 que se expresan durante la infección de papa (Solanum tuberosum), utilizando esta técnica. Primero, se construyó una cepa reportera de R. solanacearum insertando el cassette res (res-KmR-sacB-res) en un gen neutro para la virulencia. Luego, se conjugó la cepa reportera con un miniT5 que posee la fusión tnpR:lacZ sin promotor. El pool de microorganismos resultantes se emplea para infectar a la papa. El gen tnpR codifica para una enzima resolvasa que reconoce y escinde los sitios res. Si un promotor de la bacteria, que se encuentra upstream a la fusión tnpR:lacZ sin promotor, es activado por señales específicas de la planta, su expresión provoca la pérdida del cassette res y por ende, la pérdida de la resistencia a kanamicina (Km), lo que permite realizar una lista de promotores que se activan in vivo. En esta tesis se construyó y caracterizó la cepa reportera de R. solanacearum raza 3 biovar 2. Luego, se conjugó esta cepa reportera con el miniT5, que posee la fusión tnpR:lacZ sin promotor, para obtener un pool de transconjugantes. Un subconjunto de clones transconjugantes de este pool se empleó para inocular la planta. Mediante los ensayos realizados, se confirmó que el sistema RIVET construído es funcional en el patosistema papa – R. solanacearum y se aislaron clones transconjugantes con promotores activados específicamente por señales de la planta. El estudio deberá ser ampliado para abarcar la totalidad del pool de microorganismos con el que se cuenta y caracterizar genotípicamente los clones recuperados de la planta, a fin de generar una lista de promotores de R. solanaceaum que se activan en la planta.