Formación y reacciones de peroxinitrito en mitocondrias: estudios con sondas, daño oxidativo y protección por magneso porfirinas

Abstract

La formación de peroxinitrito en la mitocondria está favorecida por el suministro constante de radical superóxido a partir de la cadena de transporte electrónico mitocondrial y la difusión de óxido nítrico que alcanza a este organelo. La mayor parte de este trabajo fue realizado en un modelo de partículas submitocondriales (PSM), en presencia de succinato y un dador de óxido nítrico, el NOC- ‐7, de forma tal de estudiar la formación y cuantificar al peroxinitrito formado por una multiplicidad de métodos incluyendo fluorescencia, quimioluminiscencia y análisis inmunoquímicos. Mientras que todas las sondas que fueron evaluadas revelaron niveles casi estequiométricos de peroxinitrito respecto a sus radicales precursores, el ácido cumarin borónico (un compuesto que reacciona directamente con peroxinitrito) fue el que mostró un perfil de oxidación más consistente en las PSM formando radical superóxido, en función del flujo de óxido nítrico. Un resultado interesante surgió de los estudios inmunoquímicos que verificaron la generación de radicales proteicos en PSM inducida por peroxinitrito. En otro tipo de enfoque, utilizamos un análogo hidrofóbico de tirosina (N- ‐t- ‐BOC L- ‐tirosina tert- ‐ butil éster, BTBE) pre- ‐incorporado en mitocondrias y PSM, el cual se nitra y oxida por peroxinitrito. En las PSM conteniendo BTBE y formando radical superóxido, la exposición a flujos de óxido nítrico, causó la oxidación y posterior dimerización de la sonda en conexión con procesos de lipoperoxidación. Las PSM suplementadas con sustratos respiratorios redujeron a las Mn(III)porfirinas (MnP) a Mn(II)P, a niveles de oxígeno fisiológicamente relevantes (3- ‐30 M); a continuación, las Mn(II)P fueron capaces de reducir al peroxinitrito a nitrito y proteger las PSM de la inhibición del consumo de oxígeno por complejo I, de la formación de radicales proteicos y de la nitración de proteínas de membrana. La pre- ‐ incubación de MnP en células endoteliales en cultivo protegió de la nitración de tirosinas proteicas mediada por peroxinitrito a partir de exposición a SIN- ‐1. A través de miscroscopía confocal Raman Resonante detectamos directamente a las MnP dentro de las células, tanto en forma reducida como oxidada; el predominio observado de la forma reducida es totalmente consistente con su rol citoprotector en procesos nitroxidativos. Globalmente, los datos apoyan la formación de peroxinitrito en mitocondrias sometidas a flujos óxido nítrico y demuestran que las MnP pueden participar de un ciclo catalítico redox a nivel mitocondrial para neutralizar el daño oxidativo dependiente de peroxinitrito.