Plataformas para acelerar el descubrimento de nanobodies contra blancos de interés biomédico y sus aplicaciones

Abstract

Además de los anticuerpos convencionales, los camélidos poseen anticuerpos carentes de cadena liviana en los que un único dominio forma el sitio de unión al antígeno. Este dominio, denominado Nanobody o VHH, es uno de los fragmentos de reconocimiento de antígeno más pequeños conocidos en la naturaleza (~15 kDa) y se caracterizan por su alta estabilidad, solubilidad y especificidad. Estas características únicas de los VHHs junto a su facilidad de manipulación mediante biología molecular convierten a los VHH en una prometedora alternativa a los anticuerpos convencionales o fragmentos de anticuerpo para numerosas aplicaciones biotecnológicas. Este trabajo de tesis tuvo como horizonte establecer tecnología local para la generación de bibliotecas de nanobodies en fagos filamentosos a partir de linfocitos B de llamas (Lama glama). Asimismo se desarrollaron metodologías que facilitan la selección y caracterización de los nanobodies de interés contra una variedad de antígenos que van desde pequeñas moléculas hasta complejas estructuras celulares. La funcionalidad de los nanobodies seleccionados se demostró en diferentes aplicaciones biotecnológicas. En la primera parte del trabajo se presenta el desarrollo de un vector de alto nivel de expresión y un sistema de biotinilacion in vivo de los nanobodies que facilita el proceso de screening y caracterización paralela de cientos de clones en forma sistematizada y rápida. El sistema tiene gran versatilidad y facilita el estudio de la reactividad de los nanobodies mediante citometría de flujo, ELISA, microscopía, inmunoprecipitación, etc. Como primer aplicación de este sistema se desarrolló un método de ranqueo de afinidad relativa por el antígeno de la población de nanobodies aislados en la etapa de selección inicial (panning) y un sistema que permite la búsqueda de pares de nanobodies para la detección del antígeno en inmunoensayos tipo sándwich, lo que permitió el desarrollo de un ELISA ultrasensible para la cuantificación de la epoxi-hidrolasa humana. 2 En la segunda parte del trabajo se describe la preparación de una biblioteca de nanobodies contra células dendríticas murinas, y la adaptación de la plataforma de descubrimiento de nanobodies para aislar anticuerpos contra receptores celulares nativos utilizando células enteras para las etapas de aislamiento y caracterización. De esta forma se aislaron anticuerpos contra el componente CD11b del receptor Mac-1, la región no polimórfica del MHC-II y contra el receptor CD45, constituyendo un desarrollo de gran relevancia debido a que, a diferencia de los anticuerpos convencionales, los nanobodies pierden drásticamente la reactividad contra su antígeno ante pequeños cambios conformacionales. Debido a eso los nanobodies seleccionados contra receptores recombinantes inmovilizados sobre poliestireno (placa de ELISA) muy raramente reaccionan en forma cruzada con el receptor nativo en las células. A pesar de esto último, y dada la importancia de dirigir la selección utilizando receptores recombinantes, se mostró que la cuidadosa elección de la forma de inmovilización del receptor recombinante, sí permite aislar nanobodies contra receptores nativos. Esto fue demostrado seleccionando nanobodies contra la cadena CD11c del receptor CDR4 que es un marcador de células dendríticas. Por último se realizó una prueba de concepto sobre la utilidad de los nanobodies como dominios de funcionalización, en este caso para conferir funciones efectoras a nanobodies con capacidad de neutralizar la toxina tetánica. Una vez aislados los nanobodies anti-toxina, se prepararon anticuerpos biespecíficos fusionándolos a los nanobodies anti- CD11b, MHCII y CD45, y se estudió su poder de neutralización y biodistribución in vivo, encontrando un dramático incremento del poder neutralizante cuando los anticuerpos neutralizantes se funcionalizaron con el nanobody anti-CD11b (que reacciona con un receptor endocítico), pero no con el anti-MHC-II o anti-CD45.