Diseño racional y síntesis enzimática de galactósidos con potencial actividad como inhibidores de galectinas

Abstract

Las galectinas, son proteínas que poseen alta afinidad por -galactósidos. Dichas proteínas poseen un dominio conservado denominado Dominio de Reconocimiento a Carbohidrato (DRC), donde se da la interacción con sus ligandos. En particular las galectinas 1 y 3 han sido ampliamente estudiadas, ya que se encuentran vinculadas a distintos procesos biológicos, entre otros adhesión celular, extravasación celular y metástasis, favoreciendo el desarrollo tumoral. Por esta razón se han convertido en un blanco prometedor para la terapia contra el cáncer ya que se podría inhibir su capacidad pro-tumorogénica bloqueando el sitio de unión a carbohidratos con glicósidos que compitan con sus ligandos naturales. En este marco el objetivo general de esta tesis fue establecer una estrategia que permitiera el diseño racional de inhibidores de galectinas con potencial actividad antitumoral. Para ello se propuso el desarrollo in silico de modelos computacionales, capaces de predecir la naturaleza de la interacción entre los ligandos seleccionados y las galectinas. Por otro lado se realizó la síntesis enzimática de dichos compuestos y la evaluación de su actividad biológica mediante estudios in vitro. Se sintetizaron enzimáticamente cinco galactósidos: -D-Galp-(16)- -D-Galp-(14)-D-Glcp (2), la mezcla -D-Galp-(16)- -D-Glcp-(14)-D-Glcp (3) y -D-Galp-(13)- -D-Glcp-(14)-D-Glcp (4), -D-Galp-(16)- -D-GlcNAcp-(14)-D-GlcNAcp (6) y el galactósido de carácter aromático bencil- -D-galactopiranósido (5), aplicando el sistema de transglicosilación catalizado por la enzima -galactosidasa de Aspergillus oryzae. Posteriormente se estudió la afinidad y especificidad de unión in silico de las galectinas 1 y 3 y los -galacto-compuestos sintetizados junto con otros disacáridos de origen comercial. Para ello se aplicaron distintas simulaciones de Dinámica Molecular, en combinación con experimentos de Docking Molecular, en la búsqueda de generar modelos computacionales capaces de reproducir y predecir las interacciones entre las galectinas y sus ligandos. A su vez, se estimaron las energías libres de unión ( G) de cada complejo galectina-ligando obtenido. Con el objetivo de validar los modelos teóricos obtenidos, se estudió la interacción galectina-ligando mediante dos ensayos biológicos in vitro: ensayo en fase sólida e ITC. Los resultados obtenidos, mostraron una óptima correlación entre los resultados experimentales y teóricos, validando los modelos generados previamente. A pesar de la complejidad intrínseca del modelado de carbohidratos y lo expuesto al disolvente del DRC, en esta tesis se obtuvieron modelos teóricos preliminares, capaces de sortear dichas dificultades. Si bien los ligandos sintetizados no mostraron afinidades superiores a las de los ligandos de referencia (lactosa y N-acetil-lactosamina), los resultados obtenidos, constituyen un estudio detallado de la naturaleza de dichas interacciones. De hecho se pudieron establecer diversos aspectos de la naturaleza química del ligando que influyen en la interacción con la galectina. Por un lado la naturaleza del enlace entre la galactosa y el segundo azúcar es fundamental, siendo los enlaces -(14) y -(13) los que presentan mayor afinidad. Otro aspecto a tener en cuenta es la identidad de dicho azúcar, determinándose que la presencia del grupo N-acetilo en el carbono 2 del residuo glucopiranósico, mejora la interacción con el subsitio D de las galectinas, tanto 1 como 3. Finalmente, la adición de un tercer azúcar no resulta beneficioso respecto a la energía de unión. Esto no quiere decir que ligandos más grandes no puedan ser más afines por la galectina, sino que en principio estructuras de tipo trisacáridos no sería suficiente y no evidencian diferencias respecto a los disacáridos. Finalmente los modelos teóricos generados en esta tesis representan un importante insumo para el diseño y síntesis de inhibidores de galectinas más potentes.