Desarrollo y validación de métodos sencillos y rápidos para cianotoxinas en el monitoreo ambiental

Abstract

La eutrofización de los ambientes acuáticos promueve la proliferación de cianobacterias, que producen una amplia variedad de compuestos altamente tóxicos para animales, las cianotoxinas. En Uruguay, los principales sistemas acuáticos (Río Negro, Río Uruguay y Río de la Plata) están seriamente afectados por floraciones de cianobacterias de géneros productores de microcistinas. Estas cianotoxinas son heptapéptidos cíclicos de elevada toxicidad, que interfieren en los principales usos del agua: producción de agua potable, recreación, producción agropecuaria, pesca, entre otros. Para evaluar y gestionar los riesgos asociados, se requieren métodos sencillos, rápidos y validados, que viabilicen su determinación a bajo costo. En esta tesis se desarrolló y validó un kit de ELISA sencillo y robusto, basado en anticuerpos policlonales, que ha permitido monitorear microcistinas en aguas de embalses y playas. Los resultados evidenciaron en espumas cianobacterianas, concentraciones extremadamente elevadas de microcistinas (1000 veces el límite para agua recreacional), que impulsaron el uso de la bandera sanitaria y sustentaron la detección visual de colonias cianobacterianas dispersas y espumas, como un criterio simple de alerta para la toma de decisiones rápidas en la gestión de playas. En una segunda etapa se avanzó en la estandarización de la inmunodetección, generando anticuerpos monoclonales de llama (Nanobodies), implementando estrategias novedosas de selección para aislar los clones de mayor desempeño analítico. Esto posibilitó el desarrollo de un ELISA de segunda generación sensible y con elevada selectividad. Ambos ensayos se han validado rigurosamente y comparado con métodos analíticos de referencia como LC-MS/MS. El nuevo anticuerpo viabilizó el desarrollo de un ensayo inmunocromatográfico en tiras, que se realiza en minutos en el sitio de interés y es adecuado para analizar aguas ambientales y potables. Para generar mayor información sobre la presencia de congéneres individuales de microcistinas, se desarrollaron métodos de MALDI-TOF cualitativos, y posteriormente cuantitativos incorporando estándares internos de síntesis sencilla. Finalmente, utilizando uno de los nanobodies biotinilado in vivo se generó un inmunoadsorbente equipado con estándar interno, que permite el análisis directo de estas toxinas por MALDI-TOF posibilitando su cuantificación ultrasensible en muestras de agua y matrices biológicas complejas