Éstude des relations pharmacodynamiques, pharmacogénétiques et pharmacocinétiques des immunosuppresseurs anticalcineurines chez les transplantés hépatiques

Abstract

Les inhibiteurs de la calcineurine (ICN) sont les immunosuppresseurs les plus employés en transplantation d organe et, malgré leur toxicité et leur efficacité imparfaite, ils resteront les premiéres options thérapeutiques dans un avenir proche. Leurs effets présentent une large variabilité intra- et inter-individuelle, qui n est pas expliquée par les différences de doses, de concentrations ou d aires sous la courbe des concentrations en fonction du temps, ce qui limite les bénéfices du suivi thérapeutique pharmacologique et suggére que d autres facteurs contribuent á la variabilité de la réponse. Comme les ICN ciblent la fonction des lymphocytes T (LT), la concentration des ICN dans les LT a été étudiée comme marqueur intermédiaire de la fonction immunitaire. Effectivement, les concentrations intra-lymphocytaires de TAC chez des transplantés hépatiques montraient une plus forte association avec le rejet aigu que les concentrations dans le sang total, probablement parce qu elles intégrent la variabilité inter-individuelle d entrée du médicament dans les LT. De la mme maniére, des études antérieures ont montré que les concentrations intra-hépatiques de TAC étaient trés bien corrélées avec les scores de rejet de Banff, alors que les concentrations résiduelles dans le sang ne l étaient pas. Les deux pourraient représenter des biomarqueurs pharmacocinétiques intéressants, quoique difficiles á mesurer. Pour se qualifier comme index d activité immunosuppressive des ICN, un biomarqueur pharmacodynamique (PD) devrait tre directement affecté par l activité du médicament, c'est-á-dire ne pas tre trop éloigné de la cible du médicament et en mme temps proche de ses effets cliniques. Comme de nombreuses preuves accréditent le concept que la suppression des LT est le mécanisme clé par lequel les ICN induisent une immunosuppression permettant de prévenir le rejet cellulaire, la fonction et l activation des LT sont des candidats séduisants pour les stratégies de suivi PD. Toutefois, á ce jour aucun biomarqueur PD ne présente tous les prérequis idéaux, c'est-á-dire est á la fois non-invasif, fiable, sensible, spécifique, reproductible et disponible rapidement. Afin d identifier des biomarqueurs PD trés spécifiques de l inhibition de la calcineurine et reflétant une part importante de la variabilité inter-individuelle, nos travaux avaient pour objectifs d explorer la pharmacodynamie des ICN, la force et la variabilité de la Ofelia Noceti Penza | Thése de doctorat | Université de Limoges | 2015 9 of 298 transmission du signal le long de l axe calcineurine, ainsi que les étapes oú les sources de variabilité PD internes (génétiques) ou externes sont les plus influentes. Dans ce but, nous avons mesuré simultanément la translocation de NFAT1 dans le noyaux des cellules mononuclées du sang périphérique (PBMC) (NFTA1 étant l isoforme prédominante de NFAT dans les LT quiescents ou activés), l expression intracellulaire d IL-2 dans les sous-populations lymphocytaires CD3+, CD4+ et CD8+, et l expression membranaire de CD25 (IL-2R ), un marqueur de surface de l activation des LT. Un essai clinique non-interventionnel a été mis en place chez des volontaires sains (VS), des patients inscrits en liste d attente de transplantation hépatique (PLA) et des patients transplantés hépatiques (PTH). Une question différente a été étudiée dans chaque groupe : HS et PLA ont été inclus pour étudier la réponse des LT au tacrolimus (TAC) exvivo dans des conditions de stimulation, ainsi que les sources génétiques potentielles de variabilité PD, respectivement dans des conditions physiologiques et pathologiques. Les PTH ont été recrutés pour étudier les relations pharmacodynamiques, pharmacogénétiques et pharmacocinétiques dans des situations d administration de tacrolimus ou de ciclosporine, c'est-á-dire d activité PD résiduelle mesurée ex-vivo en conditions de stimulation ou non. Le petit groupe de PTH (n=6) inclus juste avant la transplantation et suivi de faon répétitive pendant la premiére année post-greffe était prévu pour explorer les relations entre PD des ICN et réponses cliniques. L étude chez les VS (n=35) : a exploré la PD du TAC au long de la voie calcineurine en exposant des PBMC ex-vivo au médicament a modélisé la transmission du signal au long de cette voie ; a examiné la variabilité inter-individuelle des paramétres pharmacodynamiques du TAC et a étudié les sources de cette variabilité et leur contribution á chaque étape de la voie calcineurine. De plus, elle nous a permis d évaluer la variabilité analytique de nos techniques ainsi que la variabilité intra-individuelle des paramétres PD du TAC. Les PLA (n = 19) nous ont permis de confirmer les résultats obtenus chez les VS, ainsi que de tester l influence potentielle de leur maladie initiale sur la pharmacodynamie ex-vivo du TAC. Les buts de l étude transversale chez des PTH (n=80) étaient d explorer la variabilité inter-individuelle de la PD des ICN dans des situations cliniques réalistes et les sources pharmacogénétiques potentielles de cette variabilité. Ofelia Noceti Penza | Thése de doctorat | Université de Limoges | 2015 10 of 298 Nous avons mesuré par cytométrie en flux la présence de NFTA1 transloqué dans le noyau des PBMC (qui est trés proche de l activité phosphatase de la calcineurine et probablement plus spécifique que la mesure ; directe de son activité, qui nécessite d inhiber d autres activités phosphatases), ainsi que la fonction (IL-2) et l activation (CD25) des LT comme marqueurs du statut de l immunité cellulaire. Les PBMC ont été séparés par gradient de centrifugation á partir d échantillons de sang total recueillis avant l administration du médicament et á jeun. Des aliquots frais de 106 PBMC dans 100 l de RPMI supplémenté ont été employés pour toutes les analyses. Les PBMC des VS et des PLA ont été exposés ex-vivo pendant 30 min á des concentrations de TAC entre 0 et 50 ng/mL avant chaque mesure. Les mesures de NFAT1 étaient précédées d une stimulation polyclonale par du phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) á 50 ng/mL et du calcium ionophore (I) á 2.5 g/ml, á 37 C dans une atmosphére humidifiée avec 5% CO2 pendant 30 min, pour garantir la translocation de NFAT1 vers le noyau. Aprés deux lavages avec du PBS 1X froid, les cellules étaient incubées dans la glace pendant 30 min avec du tampon de lyse PIPE (pH 7,4 dans le PBS 1X) pour perméabiliser les noyaux cellulaires. Aprés deux nouveaux lavages avec de la BSA á 1% dans le PBS 1X, 50 L d un mélange d anticorps anti-NFAT1 á 5g/ml dans le PBS 1X étaient ajoutés au milieu pour 30 min d incubation dans la glace. Puis des Ig polyclonales á 0,33% marquées au PE (fragment F(ab )2 de chévres anti- IgG(H+L) de souris) étaient ajoutées. Aprés 15 min d incubation dans la glace á l abri de la lumiére, le signal fluorescent résultant des noyaux de PBMC marqués a été mesuré par cytométrie de flux et l intensité de fluorescence moyenne de NFTA1 dans les noyaux isolés utilisée pour les analyses statistiques. La mesure d IL-2 intra-cellulaire a nécessité 5h d activation polyclonale avec du PMA/I et de la bréfeldine á 1 g/ml (pour arrter la sécrétion de protéines) á 37% en atmosphére humidifiée avec 5% de CO2. Les cellules étaient alors : i) marquées avec des marqueurs de surface anti-LT humain (CD3 PerCP-Cy5.5, CD4 FITC, CD8 PE-Cy7); ii) fixées : iii) perméabilisées (IntraPrep) ; iv) marquées avec des anticorps PE de rat anti-IL-2 humains et avec des IgG2a PE de rat comme controle isotypique. Pour la mesure d expression de CD25, des aliquots de PBMC ont été incubés pendant 72h á 37 C et 5% de CO2 en présence de 7,5 g/ml de Concanavaline A dans du RPMI 1640 1X. Ofelia Noceti Penza | Thése de doctorat | Université de Limoges | 2015 11 of 298 Aprés deux lavages additionnels dans le PBS 1X, un marquage direct était réalisé avec : CD3 PerCPCy5.5, CD4 PE, CD8 PE-Cy7 et CD25 APC. L analyse par cytométrie de flux était pratiquée aprés 30 min d incubation dans le noir et deux lavages avec de la BSA dans du PBS 1X. De plus, pour les PLA et PTH, un aliquot de PBMC a été analysé sans stimulation ex-vivo (NS condition) pour NFAT1, IL-2 et CD25. L expression d IL-2 et CD25 a été exprimée en pourcentage de cellules fluorescentes sur le nombre total de cellules CD4+, CD8+ ou CD3+, respectivement. Les cytométres de flux employés pendant ce travail étaient un LSRFortessa et un CantoII (Beckton-Dickinson), chacun équipé de 3 lasers. Les lymphocytes ont été choisis