Identificación y caracterización genética de cepas de Aspergillus productoras potenciales de ocratoxina A (OTA) en uvas y vinos de Vitis vinífera L. cv Tannat

Abstract

El género Aspergillus tiene una importancia industrial considerable debido a la capacidad de producir enzimas y ácidos orgánicos que presentan algunas de sus especies. Sin embargo, otras especies del mismo género son capaces de producir deterioro y contaminación de ciertos sustratos alimentarios así como de sintetizar micotoxinas, entre las que se destacan por su importancia como contaminantes las aflatoxinas, fumonisinas y la ocratoxina A (OTA). La OTA es un metabolito secundario con propiedades neurotóxicas, inmunotóxicas, genotóxicas y teratogénicas en animales, y ha sido clasificada por la Agencia Internacional de Investigación del Cáncer como un posible cancerígeno crónico en humanos (Grupo 2B), tras su consumo habitual. Las principales fuentes de exposición humana a la OTA son los cereales, seguidos del vino, el café y la cerveza. Su contenido máximo en estos y otros productos alimentarios está regulado principalmente por la Unión Europea. En particular, para el caso de viñedos en los que se produzca una infección importante, las principales especies de Aspergillus productoras de OTA en uvas son A. carbonarius y los miembros del agregado A. niger (A. niger y A. tubingensis) de la sección Nigri. También pueden aparecer especies uniseriadas y A. ochraceus de la sección Circumdati. Esta situación determina que, para minimizar la presencia de especies del género Aspergillus, y la concomitante entrada de OTA y otras micotoxinas en la cadena alimentaria vitivinícola, es muy importante disponer de herramientas de diagnóstico rápido, para poder monitorear de forma efectiva los puntos críticos de control. En este trabajo, se realizó un estudio sobre la biodiversidad de especies fúngicas durante las vendimias 2007-2008-2010 sobre 22 predios comerciales de la variedad Tannat en la región sur del Uruguay. Como resultado se aislaron un total de 1153 cepas identificadas inicialmente como Aspergillus. El reconocimiento macroscópico y microscópico de las especies de este género se realizó siguiendo claves precisas y se encontraron varios grupos y subgrupos de aislamientos de acuerdo a las características morfológicas de las colonias. El color de las colonias en PDA fue el carácter discriminatorio utilizado a priori para clasificar los aislamientos en 4 subgrupos. Se desarrollaron ensayos de PCR específicos para la caracterización y confirmación de la identificación de las principales especies de Aspergillus presentes en uvas (A. carbonarius, A. niger, A. tubingensis y A. ochraceus). Los cebadores utilizados en estas reacciones están _____________________________ _________________________________________________________________________ 2 diseñados a partir de la comparación de secuencias de la región espaciadora intergénica del rADN (ITS), en diversas cepas y especies de Aspergillus. La identificación fenotípica y genotípica con los cebadores OCRA1/OCRA2 coincidieron en la determinación de la presencia de 8 cepas de A. ochraceus que representan un 0,2% de total de los aislamientos. En ninguno de los aislamientos se obtuvo producto de amplificación para los primer CAR1/CAR2 por lo que no habría presencia de cepas de A. carbonarius en los viñedos analizados. Sin embargo más de un 50% de los aislamientos serían ocratoxigénicos según la amplificación del cebador AoLC35-12L/AoLC35-12R. Debido a la ausencia de aislamientos A. carbonarius y a la baja incidencia de A. ochraceus, los responsables de la presencia de OTA en vinos serían las especies pertenecientes a la sección Nigri. Se analizaron las características climáticas de cada viñedo en particular y la ocurrencia de otros factores sobre la presencia de las especies de Aspergillus y sus niveles de producción de OTA. La altura del plano de poda y la compactación de la canopia son los que mostraron mayor incidencia. Las correlaciones se comprobaron bajo condiciones experimentales y se confirmó que el microclima al que están expuesto los racimos y el vigor de las plantas son determinantes en el grado de infestación y la presencia de OTA en los vinos. Por este motivo la aplicación de prácticas de manejo en los viñedos son recomendables para reducir el riesgo de crecimiento y producción de OTA por las cepas de Aspergillus presentes. Si bien en ninguno de los vinos producidos se obtuvieron valores superiores al límite de 2 g/l de OTA, la presencia en los viñedos de cepas productoras y potencialmente productoras y las condiciones climáticas cambiantes, predisponen a aumentar el riesgo. Esta situación debe evaluarse periódicamente en un sistema de calidad por un Análisis de Peligros y Puntos Críticos de Control (APPCC).