Hybrid nanostructured supports for magnetic hyperthermiamediated activation of enzymes

Abstract

La nanobiotecnología se ha beneficiado recientemente del uso de nanobiocatalizadores inmovilizados aplicados a la biorremediación, bioprocesos sintéticos y biomedicina, entre otros campos. La integración enzimática en materiales híbridos permite capitalizar las ventajas sinérgicas de los diferentes materiales estructurales para mejorar las propiedades del biocatalizador. En esta tesis, hemos estudiado la síntesis de nanopartículas nanohíbridas [silica biomimética + nanopartículas magnéticas (MNPs)] como un vehículo de peroxidasa de rábano picante (HRP) para su uso en la terapia dirigida de profármacos de enzimas (DEPT). DEPT usa enzimas exógenas introducidas artificialmente en el cuerpo con el objetivo de convertir profármacos en su forma activa en el sitio deseado del organismo y, por lo tanto, tiene una ventaja sobre las terapias estándar no específicas por su selectividad potencial. El uso de enzimas enzapsuladas o unidas a nanopartículas (NPs) ha ganado interés en este tipo de terapia ya que permite mejorar la estabilidad y reducir la inmunogenicidad de la enzima terapéutica, a la vez que mejorar la bioacumulación y retención de la enzima en el tejido tumoral. Esto es debido al efecto de retención y permeabilidad aumentada (EPR) por la presencia de una abundante vascularización inmadura en el tumor que hace que de forma pasiva se acumulen mayor cantidad de NPs que en tejidos sanos. Por tanto, las enzimas terapéuticas transportada por NPs tienen una mayor facilidad en acumularse en tejidos tumorales que la misma enzima administrada en forma libre. Sin embargo, las NPs no pueden evitar la distribución no selectiva en el cuerpo, sobre todo en órganos que para filtrar la sangre también usan el efecto EPR (hígado, bazo)., Por lo tanto, el uso exitoso de modalidades de DEPT que utilicen nanomateriales como vehículos de la enzima terapéutica depende de la implementación de estrategias que puedan proporcionar un control espaciotemporal sobre su actividad enzimática. Para esto, en esta Tesis se ha optimizado la co-encapsulación de MNP junto con la enzima terapéutica HRP en nanopartículas de sílica biomimética. Se eligió HRP debido a su capacidad para convertir el ácido indol-3-acético (hormona vegetal) en radicales peroxilados con actividad citotóxica en varias líneas celulares tumorales. Sin embargo, la HRP tiene una temperatura óptima de 45C y a la temperatura corporal su actividad biocatalítica no es máxima. Debido a que las MNPs pueden absorber energía en presencia de un campo magnético alterno externo (AMF) y liberarla al medio ambiente en forma de calor, nuestra hipótesis de trabajo se centra en lograr utilizar este calor para 3 alcanzar la temperatura óptima de la HRP de forma localizada (en una escala nanométrica), y así incrementar su actividad enzimática. Tradicionalmente, el desencadenar el aumento macroscópico de la temperatura de tejidos tumorales ha sido la estrategia más difundida para utilizar el gradiente muy alto de temperatura que se genera por calentamiento magnético en pocos nanómetros desde la superficie de la MNPs. Esto ha permitido el desarrollo de una nueva terapia para el tratamiento del cáncer, conocida como hipertermia magnética (MHT), ya que las células tumorales tienen una mayor sensibilidad al calor que las células normales. En esta Tesis sin embargo proponemos aprovechar este gradiente de temperatura localizado alrededor de las MNPs no para desencadenar que se eleve de forma macroscópica la temperatura de un tejido tumoral sino para modular la aactividad de enzimas co-entrapadas con las MNPs en nanohíbridos de sílica biomimética. El uso de silica biomimética en el nanohíbrido se planteó bajo la premisa de utilizar un medio para estabilizar la enzima, que permita su probable inmunoaislación y, como se demostró más tarde, alcanzar a su vez un posible efecto de aislamiento térmico que disminuya la rápida disipación de calor que ocurre a pocos nm de la superficie de las MNPs y así sea posible modular la actividad de enzimas que no se encuentren unidas a la superficie de las MNPs. Es así que efectivamente la estrategia de co-encapsulación facilitó un aumento selectivo en la actividad biocatalítica de HRP al alcanzar localmente su temperatura óptima. Para llegar a esta conclusión, hemos optimizado la síntesis de los nanohíbridos variando diferentes parámetros tales como: i) tamaño del catalizador aminado requerido para la formación de NP de sílica (polietilenimina MW ~ 1300, 2000, 25000, 60000 Da), ii) metodología de inmovilización de la HRP (adsorción / unión covalente en MNP antes de la encapsulación, co-encapsulación con MNP), iii) relación HRP/ MNP. La inmovilización de HRP y los rendimientos de actividad después del atrapamiento son similares con o sin MNP (~ 60 4% y 78 1, respectivamente). Sin embargo, la estabilidad térmica de la enzima (50C) aumentó 532 (Factor de estabilización) cuando la HRP se co-encapsula con MNP. El uso de PEI de diferentes tamaños no afectó los rendimientos de la inmovilización de HRP ni el tamaño (diámetro hidrodinámico) de los híbridos. Sin embargo, las MNP parecen actuar como plantillas para la deposición de sílice ya que su co-encapsulación con HRP reduce el tamaño radio de los biohíbridos (de ~ 800-1000 a 500-600 nm). Todos los nanohíbridos obtenidos pudieron oxidar IAA, pero no se observó citotoxicidad en 4 ausencia del profármaco usando diferentes líneas celulares. También hemos estudiado el efecto del tamaño del catalizador aminado requerido para la formación del nanobiocatalizador (polietilenimina MW ~ 1300, 2000, 25000, 60000 Da), en su eficiencia de calentamiento magnético macroscópico (SAR, Specific Absorption Rate o tasa de absorción específica) y nanoscópico (activación enzimática). Los nanohíbridos (500-600 nm) mostraron activación enzimática (250-300%) sin un aumento significativo de la temperatura macroscópica y conservaron su actividad completa después de la aplicación de un ciclo de AMF (829 kHz, 25.2 mT) durante 20 min. Sin embargo, para que los nHs desarrollados puedan tener potencial para ser utilizados en DEPT es clave que presenten buena estabilidad coloidal en medios biológicos complejos. Para ello fue necesario bloquear grupos amino primarios presentes en la superficie de los mismos con glucosa. Este monósocaráido no solo permitió mejorar la estabilidad coloidal de los nHs en medio de cultivo completo, pero también sirve de biomoléculta para vectorización activa de células tumorales. Los nanohíbridos funcionalizados con glucosa lograron diferencias significativas en la reducción de la viabilidad celular de una línea celular de cáncer de colon humano (HCT-116) después de la exposición a un ciclo de AMF (80% versus 30% de reducción en controles sin aplicación de AMF). Estos resultados muestran por primera vez que es posible controlar de forma remota la actividad de HRP co-atrapada con MNP mediante calentamiento magnético para una potencial aplicación en terapia antitumoral DEPT.