Derivados oxidados del tiol de la albúmina humana

Abstract

La albúmina sérica humana (HSA), es una proteína monomérica compuesta por tres dominios, conocidos como dominios I, II y III. Presenta en su estructura 17 puentes disulfuro y una única cisteína libre (Cys34) que se localiza en el dominio I (DomI). La HSA es la proteína mayoritaria del plasma y su tiol se encuentra principalmente reducido (HSA-SH), constituyendo el 80% de los tioles reducidos en el compartimiento intravascular. Una fracción menor se encuentra formando disulfuros con tioles de bajo peso molecular (HSA-SSR) u oxidado a ácidos sulfínico (HSA-SO2H) y sulfónico (HSA-SO3H). En esta tesis se profundizó en el análisis de las isoformas de la HSA en plasma mediante cromatoenfoque y se trabajó en la expresión, purificación y caracterización del dominio I (DomI) de la HSA producido en Pichia pastoris. En cuanto al cromatoenfoque, se realizó una puesta a punto del análisis de muestras de plasma de donantes sanos mediante controles de precipitación de HSA en el amortiguador de trabajo y estableciendo la cantidad de HSA a inyectar para obtener una buena resolución. El cromatoenfoque es reproducible y puede utilizarse tal como se puso a punto, para estudiar el aumento de las fracciones oxidadas de la HSA de personas con sepsis. Por otra parte, se expresó el DomI en P. pastoris a partir de dos construcciones. Una conteniendo dos mutaciones sinónimas en su secuencia (DomIMS) y otra generada a partir de la secuencia de referencia de la HSA (DomISR). Ambos DomI se expresaron y secretaron correctamente hacia el medio de cultivo, y mostraron la presencia de un pigmento marrón. Respecto al DomIMS, la eliminación de la mayor parte del pigmento se logró con una cromatografía de intercambio catiónico a pH 5.0 y elución con NaCl 1 M. La reducción selectiva de dicha cisteína se logró por incubación con 2-mercaptoetanol, como se vio por reacción con 5,5-ditiobis(2-nitrobenzoato) (DTNB) y espectrometría de masa. Además se determinó la constante de reacción de la Cys34 de DomI con DTNB. El valor de 229 M-1 s-1 resultó 16 veces mayor que el de la HSA deslipidada, en iguales condiciones experimentales. En relación al DomISR, se transformaron células de la cepa GS115 His- Mut+, se seleccionaron primero transformantes, y luego transformantes multicopia. Se prepararon crioinóculos que expresaron el DomISR correctamente. En un ensayo preliminar se vio que la Cys34 del DomISR se reduce en iguales condiciones que la del DomIMS y reacciona con DTNB con una constante similar, sugiriendo que no existen diferencias estructurales entre ambos