Producción, caracterización bioquímica e inmovilización de lipasas microbianas y sus aplicaciones

Abstract

La biocatálisis, también conocida como catálisis enzimática o biotransformación, es el uso de enzimas para catalizar reacciones químicas. El campo de la biocatálisis crece con el afán de desarrollar procesos químicos y biotecnológicos más eficientes y de menor impacto ambiental. El uso de enzimas aisladas o células enteras como catalizadores ofrece varias ventajas, son muy eficaces, funcionan a temperaturas y condiciones de pH suaves y en entornos acuosos, ofrecen una gran especificidad (quimio-, regio-, diastero- y enantioespecíficas) lo que las torna herramientas sumamente interesantes en diferentes procesos industriales. Las lipasas (triacilglicerol hidrolasas, EC 3.1.1.3) son una importante clase de enzimas con un gran número de aplicaciones en biotecnología. Una de las aplicaciones con potencial impacto industrial es la producción de biocombustibles. El biodiesel se sintetiza a partir de triglicéridos de distinto origen, mediante transesterificación con alcoholes de cadena corta como metanol o etanol, actualmente el proceso más utilizado su síntesis es la catálisis química homogénea. Las lipasas son una alternativa con potencial para conducir este proceso, mediante su aplicación es posible obtener una mezcla de esteres dentro de los parámetros de calidad requeridos para este combustible. Con el fin de lograr la expansión de esta metodología a nivel industrial es fundamental desarrollar biocatalizadores eficientes y económicos. El desafío de desarrollar nuevos biocatalizadores aplicables a nivel industrial pasa por la búsqueda de enzimas con características bioquímicas tales que se puedan adaptar a los sistemas de producción y por desarrollo de biocatalizadores inmovilizados de las mismas, que aumente la eficiencia del proceso. El presente trabajo se centró en la identificación, purificación y desarrollo de biocatalizadores inmovilizados de lipasas microbianas, con las características necesarias para su aplicación a la síntesis de biodiesel. Se desarrollaron estrategias bioquímicas y moleculares para la identificación, producción, y purificación de enzimas con actividad lipasa a partir de sobrenadante de medio de cultivo de una cepa de Janibacter sp, el cual demostró capacidad de conducir la síntesis de biodiesel. Además, se diseñaron y desarrollaron estrategias de inmovilización de otras lipasas, las cuales se basaron en diferentes químicas de unión. Los derivados inmovilizados obtenidos fueron evaluados respecto a su capacidad de estabilizar a la enzima inmovilizada frente a su exposición a la temperatura, respecto a la enzima en solución. A partir de las estrategias bioquímicas diseñadas se purificaron fracciones con actividad lipasa, seleccionándose particularmente una de ellas (Lip J1) la cual fue caracterizada parcialmente. Mientras que la estrategia molecular permitió la identificación del gen codificante para una segunda enzima (Lip J2), para la cual se desarrollaron diferentes sistemas de expresión a partir de los cuales fue posible purificarla. Esta enzima presentó características bioquímicas interesantes, siendo catalogada como halófila, basófila e hipertermófila, mientras que su caracterización estructural la clasificó como el primer miembro de la familia XVII de lipasas. Las dos enzimas identificadas a partir de Janibacter R02 (Lip J 1 y Lip J2) presentaron características bioquímicas distintas e interesantes, que las convierten en candidatas para su aplicación a diferentes procesos químicos. Por otro lado, el trabajo centrado en lipasas de Aspergillus niger permitió la obtención de tres derivados inmovilizados de forma covalente a través de tres químicas de unión diferentes, utilizando agarosa como soporte. Dos de las estrategias utilizadas mostraron una eficiencia de inmovilización muy buena con porcentajes de actividad expresada de 69%. Los tres derivados enzimáticos fueron evaluados frente a la temperatura, dos de ellos mostraron una importante estabilización térmica a 40 °C, lo cual los posiciona como buenos candidatos para su aplicación en la síntesis de biodiesel. También fueron realizados ensayos de inmovilización de la lipasa BTL 2 de Geobacillus thermocatelatus sobre nanopartículas con propiedades superparamagnéticas, para su aplicación a ensayos de nanocalentamiento magnético, a partir del cual se estudió diferentes técnicas de funcionalización del soporte y su aplicación a la hipertermia magnética. Finalmente se muestran los resultados acerca de la capacidad catalítica de la arginina sobre la hidrólisis del sustrato modelo pNP Butirato. Este hecho fue descubierto de forma fortuita y su novedad nos llevó a profundizar en las características de este fenómeno, logrando proponer y evaluar un modelo que explique la interacción que se da entre estos dos compuestos. A nuestro entender este sería el tercer reporte de un aminoácido con capacidad catalítica.