Calidad y capacidad fertilizante in vitro de semen de toros criollo uruguayo crioperservado en dos diluyentes comerciales y análisis de variabilidad genética

Abstract

La Facultad de Veterinaria (Universidad de la República, Uruguay) cuenta con un banco de semen de unas 800 pajuelas de bovinos Criollo Uruguayo (BCU) de la reserva de San Miguel (~600 animales) congelado en dos diluyentes comerciales, Andromed® (A) sin yema de huevo y Triladyl® (T) con yema de huevo. El objetivo de esta tesis fue conocer la calidad y capacidad fecundante in vitro (FIV) del semen contenido en el banco y estudiar marcadores moleculares tipo polimorfismo de un solo nucleótido (SNP). Se realizaron 3 experimentos: Experimento 1: Semen congelado de 8 toros, diluido en T y A (16 muestras) fueron evaluados por sistema computarizado (CASA) inmediatamente post-descongelado: concentración, motilidad, cinética, morfología y se realizó test hiposmótico, repitiéndose motilidad y cinética a las 2h post-descongelado. Se aplicó el test-T para tiempo y diluyentes y percentiles para categorizar las 16 muestras. Experimento 2: 404 complejos ovocito-células del cúmulo (COC) calidad A, obtenidos de ovarios bovinos de frigorífico, fueron madurados en TCM-199 adicionado con 5% de suero fetal bovino (SFB) y hormonas, en gotas cubiertas con aceite mineral a 38,5ºC, 5% CO2 y humedad saturada; tras 22h en incubadora los COC se inseminaron con semen de 4 toros diluido en A y T, seleccionado por centrifugación en gradientes de Percoll® (90/45%) en Talp-Sperm. Se formaron gotas con Talp-Fert con 2x106spz/ml y se colocaron los COC en cocultivo por 18h. Los presuntos cigotos se denudaron y cultivaron en medio CR1aa con SFB (5%). Se evaluó clivaje (48h) y desarrollo embrionario (DE) al día 7. Los resultados de la FIV se analizaron mediante Chi-cuadrado. Experimento 3: consistió en el análisis de frecuencias de SNP, localizados en genes (IGF1, IGFR1, SEPT12, CCT6A, 7SK, HS6ST2, SFMBT1, SOX5) relacionados con fertilidad en los 26 toros de la reserva. El genotipado se realizó mediante análisis automatizado (Axiom™ Bovine Genotyping v3 Array), de muestras de ADN obtenidas a partir de folículo piloso. Las muestras de semen estudiadas presentan una calidad espermática cuestionable, dados sus valores de motilidad progresiva (MP), solo 10 de las 16 muestras, contienen una dosis inseminante adecuada, con resultados similares de motilidad y HOST para ambos diluyentes (A y T). Uno de los toros presentó exceso en anomalías espermáticas. No hubo diferencias significativas en el clivaje ni en el DE entre diluyentes. Se encontraron diferencias significativas en clivaje solamente entre dos de los toros (p=0.008) pero no entre ellos respecto a los otros dos toros. No hubo diferencias significativas en DE. En la población estudiada (26 toros) se identificaron 26 polimorfismos tipo SNPs en 6 genes vinculados a fertilidad (IGF1R, SEPT12, CCT6A, HS6ST2, SFMBT1 y SOX5) de los cuales el 54% resultaron fijados, esto podría deberse a que nos encontramos con una población cerrada desde el punto de vista genético con características raciales propias. El semen estudiado podría ser utilizado para inseminación artificial u otras biotecnologías reproductivas (no comercialmente) en el marco de los esfuerzos conservacionales de la raza, salvo el semen de uno de los toros, que presentó problemas graves en la morfología espermática.