Puesta a punto y validación de metodologías basadas en ADN para diagnóstico de nemátodos gastrointestinales de ovinos en Uruguay

Abstract

El recuento de huevos de nematodos gastrointestinales (NGI) en heces es el método más utilizado para estimar la carga parasitaria en ovinos. La composición de las especies se realiza mediante coprocultivos y clasificación morfológica de las larvas infectantes (L3) obtenidas, lo cual es laborioso y demorado. Actualmente se dispone de métodos moleculares, los cuales proclaman ser más rápidos y eficientes. El objetivo de esta tesis fue poner a punto una PCR convencional para la tipificación de géneros y especies de NGI más prevalentes de ovinos y una PCR en tiempo real (qPCR) para la tipificación y cuantificación del género Haemonchus. Los ensayos se basaron en combinaciones de cebadores y sondas específicas de género de NGI derivadas de la segunda unidad de transcripción de ADN ribosómico nuclear del espaciador transcrito interno (ITS2). Como ADN molde se utilizó ADN genómico de huevos y larvas infectantes de NGI. Para ello, se obtuvieron 24 muestras de materia fecal de ovinos en pastoreo de distintas razas y categorías. En este estudio se logró exitosamente el desarrollo y validación de los protocolos de PCR convencional para Haemonchus contortus, Teladorsagia circumcincta y Trichostrongylus spp., identificándose bandas de 106 pb, 226 pb y 147 pb para cada uno de los respectivos NGI. Asimismo, se observó que los mejores resultados se obtienen cuando se utilizó ADN de larvas infectantes provenientes de coprocultivos. El análisis de Kappa de Cohen para concordancia entre la clasificación morfológica de las L3 y PCR fue de 82,4% (p=0.000) indicando excelente acuerdo entre ambos métodos. Este trabajo también indicó que es posible un diagnóstico confiable mediante qPCR de Haemonchus sp., utilizando ADN extraído directamente de huevos recolectados de materia fecal. Se encontró una correlación positiva y alta (R2= 0,75, p<0,05) entre los recuentos de huevos por gramo y cuantificación de ADN de Haemonchus sp. en la qPCR, sugiriendo que la cuantificación de este género mediante qPCR, es factible. Sin embargo, son necesarios más estudios, fundamentalmente en la extracción de ADN de huevos de estrongílidos de ovinos y cuantificación de los otros NGI prevalentes en ovinos. En conclusión, los resultados presentados en esta tesis muestran que las pruebas moleculares pueden ser incluidos en los estudios sobre NGI de los ovinos.