Obtención de células madre mesenquimales extraídas de tejido adiposo y pulpa dental en felinos y evaluación de sus características in vitro

Abstract

Las células madre mesenquimales (CMM) han sido el foco de interés en los últimos años desde el punto de vista terapéutico por presentar características únicas como autorenovación, multipotenicalidad, migración al foco inflamatorio, inmunomodulación y angiogénesis. En especies domésticas, las más estudiadas son las células madre derivadas de tejido adiposo (TA) que han sido utilizadas en terapias en felinos. Otra fuente es la pulpa dental descrita en humanos, pero no en felinos, lo cual representa una fuente alternativa de células madre con características diferenciales por su origen embrionario particular. El objetivo del presente trabajo fue estudiar y evaluar las características in vitro y estabilidad citogenética de dos fuentes de células madre (CM) felinas: las derivadas de tejido adiposo (CMM TA) y de pulpa dental (CMPD). Para ello se estudiaron 13 cultivos de CMM TA aisladas por método enzimático y 2 cultivos de CMPD aisladas por método de explante. Se evaluó su morfología in vitro mediante tinción Giemsa, en pasajes 2, 4 y 6. Se estudió su capacidad clonogénica mediante test de Unidades Formadoras de Colonias Fibroblásticas y su proliferación mediante tiempo de doblaje en pasajes 2, 4 y 6. Se evaluó la multipotencia la tridiferenciación in vitro (osteogénica, adipogénica y condrogénica). Se realizaron estudios citogenéticas en estos sucesivos pasajes celulares in vitro, de ambas fuentes, en busca de posibles alteraciones cromosómicas numéricas o estructurales que puedan comprometer su utilización terapéutica in vivo. Se logró el aislamiento exitoso de 19 muestras de grasa y 2 muestras de pulpa dental. Las CMM TA presentaron una morfología fusiforme mientras que las CMPD presentaron una población con células fusiformes y epitelioides. La relación núcleo citoplasma fue menor para las CMPD. Ambas fuentes manifestaron una buena capacidad clonogénica. El tiempo de doblaje para las CMM TA fue de 2,52 días en pasaje 2, de 9,41 en pasaje 4 y de 10,55 en pasaje 6, mientras que para las CMPD fue de 2,48 y 5,11 días en pasaje 2, de 7,61 y 12,28 en pasaje 4; de 7,61 y 10,24 en pasaje 6. Se observaron alteraciones nucleares como cariorrexis y cariolisis en pasaje 4 de CMM TA, que a su vez coincidió con un aumento en el tiempo de doblaje y una caída del índice mitótico de estas células, disminuyendo su crecimiento a partir de este pasaje. Ambas fuentes fueron capaces de diferenciar al trilinaje. Se analizaron 266 metafases en pasaje 2 de CMM TA y 47 en pasaje 4, observándose mayormente cariotipos normales aunque se evidenciaron signos de inestabilidad estructural como gaps, fracturas, deleciones, duplicaciones y separaciones tempranas de cromátida. Se analizaron 19 metafases en pasaje 2 de CMPD y 47 en pasaje 4, observándose un patrón de alteraciones similar a las CMM TA. Este es el primer reporte de aislamiento de CMPD felinas y el primer estudio de estabilidad in vitro de ambas fuentes de CM felinas en sucesivos pasajes.