Criopreservación en embriones ovinos producidos in vitro en diferentes estadios mediante dos métodos de vitrificación

Abstract

Diferentes protocolos de vitrificación han sido evaluados en los últimos años en embriones ovinos producidos in vivo. Sin embargo, ninguno de ellos permite una gran sobrevivencia cuando se aplica a embriones producidos in vitro. El objetivo de esta tesis fue evaluar dos nuevos métodos de vitrificación (Cryotop y Espátula) nunca antes evaluados en ovinos para la criopreservación de embriones al Día 2 o al Día 6 luego de la fertilización in vitro (Día 0). Complejos cumulus ovocitos fueron madurados, fertilizados y cultivados in vitro hasta el Día 8. Al Día 2 los embriones fueron asignados al azar a 5 grupos experimentales de los cuales dos grupos fueron vitrificados en el Día 2 por el método Cryotop o Espátula; dos grupos fueron vitrificados en el Día 6 por el método Cryotop o Espátula; y un grupo no fue sometido a vitrificación permaneciendo los embriones en cultivo in vitro como grupo control. Luego de la vitrificación y el calentamiento los embriones continuaron su desarrollo in vitro junto con el grupo control hasta el Día 8. Se determinó la tasa de sobrevivencia a las 3 h y 24 h luego del calentamiento, la tasa de desarrollo al Día 6, la producción de blastocistos al Día 8, y la tasa de eclosión al Día 8 sobre el total de blastocistos en ese Día así como sobre el total de embriones clivados en el Día 2. Asimismo se determinó el número total de células presentes en blastocistos expandidos en el Día 7. Los resultados demostraron que la tasa de sobrevivencia a las 24 horas luego de la vitrificación-calentamiento y la producción de blastocistos en el Día 8 se vieron afectadas por el estadio del embrión, siendo menor para aquellos vitrificados en el Día 2 comparados con embriones vitrificados en el Día 6 (P<0,05). Comparado con el grupo control sin vitrificar, los embriones vitrificados en el Día 2 presentaron una menor tasa de desarrollo en el Día 6 (P<0,05), no encontrando un efecto del método de vitrificación utilizado (Cryotop o Espátula) (P=NS). La tasa de eclosión sobre el total de los blastocistos presentes al Día 8 no estuvo afectada por la vitrificación, siendo similar a los embriones no vitrificados (P=NS). A pesar de que los embriones en estadios tempranos mostraron menor criotolerancia, aquellos embriones que sobrevivieron el proceso de vitrificación-calentamiento tuvieron una alta capacidad de desarrollo y de eclosión, similar a la vitrificación en los estadios de mórula o blastocisto. El número total de células no mostró diferencias entre los grupos experimentales evaluados. El método de vitrificación no afectó ninguna de las variables evaluadas, sin embargo, sí se encontró un efecto del estadio embrionario al momento de realizar la vitrificación. En conclusión, ambos métodos Cryotop y Espátula permiten una aceptable tasa de sobrevivencia y desarrollo en embriones ovinos producidos in vitro y vitrificados en el Día 2 o en el Día 6. La vitrificación mediante estos dos métodos de enfriamiento ultra-rápido y volumen mínimo representan una alternativa promisoria para embriones ovinos en diferentes estadios producidos por fertilización in vitro.