Enriquecimiento y análisis de RNAs 5′-trifosforilados en células THP-1 no diferenciadas y diferenciadas

Abstract

La transcripción mediada por RNA polimerasas genera RNAs con extremos 5′-trifosfato (RNAs 5′ppp), una característica con varias implicancias biológicas. Por un lado, numerosos virus presentan RNAs con extremo 5′ppp, que actúa como una firma molecular reconocida por receptores de reconocimiento de patrones (PRRs) y, por lo tanto, como una señal de alarma para el sistema inmune. Por otro lado, cuando los RNAs endógenos con extremos 5′ppp quedan desprotegidos o se localizan de manera anómala a nivel subcelular, pueden ser reconocidos erróneamente como material extraño y desencadenar respuestas inflamatorias o incluso reacciones autoinmunes. A pesar de su relevancia biológica, la caracterización de RNAs 5′ppp continúa siendo desafiante, ya que suelen encontrarse en baja abundancia y su extremo 5′ppp es poco compatible con los métodos convencionales de preparación de bibliotecas, lo que puede resultar en su subrepresentación en los análisis de secuenciación. Con el objetivo de abordar esta limitación, adaptamos la estrategia Cappable-seq para el estudio de RNAs 5′ppp endógenos. Este enfoque utiliza la enzima Vaccinia Capping Enzyme (VCE) para incorporar un análogo de guanosina trifosfato modificado con destiobiotina (3′-DTB-GTP) en los extremos 5′ppp, permitiendo su enriquecimiento por afinidad. Esta estrategia se aplicó a RNA total obtenido de células THP-1 sin diferenciar y diferenciadas con PMA (forbol 12-miristato 13-acetato), lo que permitió perfilar los RNAs 5′ppp mediante secuenciación de nueva generación. El análisis reveló que la metodología logró enriquecer RNAs previamente descritos como 5′ppp, entre ellos pre-tRNAs, RNA 5S, 7SK, 7SL e Y RNAs. Los resultados de secuenciación fueron concordantes con la validación ortogonal mediante Northern blot, que aportó evidencia adicional del enriquecimiento de moléculas compatibles con un extremo 5′ppp. Estos resultados abren nuevas perspectivas para explorar este grupo de RNAs en distintos contextos, como su rol en células inmunes.