Identificación y caracterización de nuevos inhibidores de las proteasas de SARS-CoV-2 con actividad antiviral

Abstract

La pandemia de la COVID-19 puso en evidencia la falta de investigación y desarrollo en el área de quimioterapia contra las enfermedades virales respiratorias agudas. Desde el inicio de la misma, las proteasas de SARS-CoV-2, MPro y PLPro, despertaron interés como dianas terapéuticas por su esencialidad para la replicación viral. Una campaña de cribado virtual y experimental llevada a cabo por nuestro grupo de investigación en conjunto con un gran número de colaboradores identificó una diversidad de compuestos químicos con capacidad de inhibir estas enzimas. Nutrido de estos antecedentes y con el objetivo de ampliar y profundizar los hallazgos, esta tesis abordó el tamizaje experimental contra la MPro de un número significativo de compuestos que no habían sido estudiados previamente (433 moléculas), la caracterización de la selectividad y modo de inhibición de la MPro de una selección de hits, la evaluación de la actividad biológica (citotoxicidad sobre célula huésped y actividad antiviral) de los nuevos hits, y la optimización de condiciones para obtener cristales de complejos MPro-inhibidor. El cribado no sesgado confirmó la robustez de los algoritmos de predicción de hits implementados en la anterior campaña de tamizaje in silico, ya que se obtuvo una tasa de falsos negativos del 2,2%. Los 17 nuevos hits identificados (tasa de éxito del 4,2%) pertenecen a cinco novedosos andamios estructurales: pirazolopirimidinas, complejos organometálicos de rutenio, dehidropiranona, rotenoides y naftoquinonas. Uno de ellos, una dehidropiranona iodada, se destacó por su potente y selectiva actividad inhibitoria sobre MPro (CI50 = 0,2 μM). Para los hits de la MPro de cada serie, las pirazolopirimidinas, los complejos de rutenio y las naftoquinonas mostraron mayor selectividad contra esta proteasa que contra la PLPro, mientras que lo inverso aplica para las rotenoides. Excepto por las naftoquinonas, el resto de los hits de la MPro mostró una nula o baja citotoxicidad sobre células de epitelio pulmonar y renal a concentraciones ≥ 50 μM. Al menos dos hits demostraron tener actividad antiviral (un complejo de Ru y una naftoquinona) en el mismo orden de potencia (dos dígitos μM) que fármacos de referencia ensayados, aunque con un índice de selectividad comprometido (IS 1,2 y >1,4, respectivamente). La caracterización del modo de inhibición sobre la MPro de un par de hits de distintas familias químicas y con probada actividad anti-SARS-CoV-2 (una naftoquinona y un derivado del Ebsulfur) mediante ensayos bioquímicos y biofísicos reveló una inhibición covalente y reversible que involucra a residuos de cisteína. Finalmente, si bien se logró cristalizar con éxito la forma libre de la MPro, no fue posible obtener cristales de complejos proteasa-inhibidor. Esto puede deberse a la baja afinidad y/o labilidad de los enlaces reversibles establecidos por algunos inhibidores, lo cual propicia su exclusión molecular durante la cristalogénesis. En conclusión, esta investigación caracterizó nuevos scaffolds químicos con potencia inhibitoria moderada frente a las proteasas MPro y PLPro, así como en modelos de infección celular por SARS-CoV-2, dilucidando mecanismos de inhibición reversibles y perfiles de citotoxicidad que ofrecen un punto de partida estratégico para el desarrollo racional de moléculas con actividad anti-SARSCoV-2.

in the field of chemotherapy against acute respiratory viral diseases. Since its onset, the SARS-CoV-2 proteases, MPro and PLPro, have attracted interest as therapeutic targets due to their essential role in viral replication. A virtual and experimental screening campaign conducted by our research group, in collaboration with a large number of partners, identified a variety of chemical compounds capable of inhibiting these enzymes. Building upon this background and aiming to expand and deepen these findings, this thesis addressed the experimental screening against MPro of a significant number of previously unstudied compounds (433 molecules), the characterization of the selectivity and mode of MPro inhibition of a selection of hits, the evaluation of the biological activity (host cell cytotoxicity and antiviral activity) of the new hits, and the optimization of conditions to obtain crystals of MPro-inhibitor complexes. The unbiased screening confirmed the robustness of the hit prediction algorithms implemented in the previous silico screening campaign, yielding a false-negative rate of 2.2%. The 17 new hits identified (hit-ratio = 4.2%) belong to five novel structural scaffolds: pyrazolopyrimidines, ruthenium organometallic complexes, dehydropyranones, rotenoids, and naphthoquinones. One of these, an iodinated dehydropyranone, stood out for its potent and selective inhibitory activity against MPro (IC50 = 0.2 μM). Among the MPro hits from each series, pyrazolopyrimidines, ruthenium complexes, and naphthoquinones showed selectivity against this protease rather than toward PLPro, whereas the inverse applied to the rotenoids. Except for the naphthoquinones, the remaining MPro hits showed null or low cytotoxicity on pulmonary and renal epithelial cells at concentrations ≥ 50 μM. At least two hits demonstrated antiviral activity (a Ru complex and a naphthoquinone) in the same order of potency (double-digit μM) as the reference drugs tested, albeit with a compromised selectivity index (SI 1.2 and > 1.4, respectively). The characterization of the MPro inhibition mode of a pair of hits from different chemical families with proven anti-SARS-CoV-2 activity (a naphthoquinone and an Ebsulfur derivative) through biochemical and biophysical assays revealed a reversible covalent inhibition involving cysteine residues. Finally, although the free form of MPro was successfully crystallized, it was not possible to obtain crystals of protease-inhibitor complexes. This may be due to the low affinity and/or lability of the reversible bonds established by some inhibitors, which promotes their molecular exclusion during crystallogenesis. In conclusion, this research characterized new chemical scaffolds with moderate inhibitory potency against the molecular targets and the virus, elucidating reversible inhibition mechanisms and cytotoxicity profiles that offer a strategic starting point for the rational development of molecules with anti-SARSCoV-2 activity.