Patrones evolutivos y mecanismos de restricción antiviral en la adaptación de virus ARN zoonóticos

Abstract

Los virus ARN presentan alta plasticidad genética, que les permite adaptarse a nuevos hospederos bajo presiones selectivas que operan a nivel poblacional e intracelular. En esta tesis se investigó cómo estas presiones moldean la arquitectura genómica y la trayectoria adaptativa de dos virus ARN zoonóticos. En el primer capítulo se utilizó SARS-CoV-2 como modelo de emergencia y diversificación reciente, evaluando su dinámica evolutiva mediante un estudio composicional del gen S en VOCs y de la emergencia de Ómicron. Análisis multivariados (PCA y mapas de calor) evidenciaron que los patrones de uso de codones y la composición nucleotídica se asocian con la diferenciación genotípica entre variantes virales. La divergencia de Ómicron no se limita a sustituciones aminoacídicas puntuales, sino que podría reflejar una reorganización más amplia de la arquitectura genómica del gen S. En particular, Alfa, Beta, Gamma y Delta mostraron mayor proximidad genética entre sí, mientras que Ómicron ocupó un espacio multivariado claramente diferenciado, consistente con una trayectoria evolutiva independiente en el árbol filogenético de SARS-CoV-2. Estos resultados sugieren que el gen S contiene suficiente información evolutiva para asignar VOCs a sus linajes incluso a partir de variables composicionales globales, reforzando su utilidad como marcador evolutivo. Asimismo, análisis filodinámicos sugieren que los ancestros de este linaje habrían circulado durante un período prolongado antes de su detección, evidenciando diversificación temprana. En el segundo capítulo se estudió el rol de la inmunidad innata como fuerza selectiva sobre arbovirus, con foco en la proteína antiviral de dedos de zinc (ZAP) de vertebrados, que reconoce dinucleótidos CpG en ARN virales. Los virus ARN que infectan vertebrados presentan una marcada supresión de CpG asociada a la actividad restrictiva de ZAP. Sin embargo, los arbovirus deben replicar eficientemente en vertebrados e invertebrados, por lo que están sometidos a presiones evolutivas potencialmente divergentes. Para abordar esta pregunta se utilizó una variante de MAYV enriquecida en CpG (FG+) y se generó una línea celular A549 deficiente en ZAP mediante CRISPR/Cas9. Los resultados evidenciaron que el aumento de CpG produce una marcada atenuación viral dependiente de este factor restrictivo. Además, se observó que la isoforma ZAPL actúa como principal mediador restrictivo durante etapas tempranas de la infección y que la estimulación con IFNα potencia esta restricción de manera dependiente de ZAP. También se evidenció que MAYV silvestre (WT) es susceptible a la inhibición mediada por ZAP, lo que sugiere que la modulación del contenido de CpG constituye un compromiso adaptativo relevante para arbovirus que alternan entre distintos hospedadores. En conjunto, estos capítulos muestran cómo distintos niveles de presión selectiva, desde procesos evolutivos poblacionales hasta mecanismos de inmunidad innata, moldean la composición genómica y el potencial adaptativo de virus ARN. Finalmente, en el tercer capítulo se exploró el rediseño del genoma de MAYV como herramienta experimental mediante la generación de variantes sintéticas capaces de expresar un ARN guía del sistema CRISPR/Cas9 dirigido contra ZAP. Aunque no se detectó edición génica eficiente en las condiciones evaluadas, los resultados demostraron la viabilidad de utilizar MAYV como plataforma para la expresión de ARN pequeños y resaltan su potencial para estudios funcionales.

RNA viruses exhibit high genetic plasticity, enabling them to adapt to new hosts under selective pressures acting at both the population and intracellular levels. In this thesis, we investigated how these pressures shape the genomic architecture and adaptive trajectories of two zoonotic RNA viruses. In the first chapter, SARS-CoV-2 was used as a model of recent emergence and diversification to examine its evolutionary dynamics through a compositional analysis of the S gene across variants of concern (VOCs), with particular focus on the emergence of Omicron. Multivariate analyses (PCA and heatmaps) showed that codon usage patterns and nucleotide composition are associated with the genotypic differentiation among viral variants. The divergence of Omicron is therefore not limited to point amino acid substitutions but may reflect a broader reorganization of the genomic architecture of the S gene. In particular, Alpha, Beta, Gamma, and Delta showed greater genetic proximity to one another, whereas Omicron occupied a clearly distinct multivariate space, consistent with an independent evolutionary trajectory within the SARS-CoV-2 phylogenetic tree. These findings suggest that the S gene contains sufficient evolutionary signal to assign VOCs to their respective lineages even using global compositional variables, highlighting its value as an evolutionary marker. Phylodynamic analyses further suggest that the ancestors of this lineage circulated for an extended period before its detection, indicating early diversification. The second chapter investigated how innate immunity shapes arbovirus genome composition, focusing on the vertebrate zinc-finger antiviral protein (ZAP), which recognizes CpG dinucleotides in viral RNA. RNA viruses infecting vertebrates typically show strong CpG suppression, a feature linked to the restrictive activity of ZAP. However, arboviruses must replicate efficiently in both vertebrate and invertebrate hosts and are therefore exposed to potentially divergent evolutionary pressures. To address this, a CpG-enriched MAYV variant (FG+) was used together with a ZAP-deficient A549 cell line generated by CRISPR/Cas9. Increasing CpG content resulted in marked viral attenuation in a ZAP-dependent manner. The ZAPL isoform was identified as the main restrictive mediator during the early stages of infection, and IFNα stimulation further enhanced this restriction in a ZAP-dependent manner. Importantly, wild-type MAYV was also susceptible to ZAP-mediated inhibition, suggesting that modulation of CpG content represents an important adaptive trade-off for arboviruses that alternate between different hosts. Together, these chapters show how selective pressures operating at different levels—from population-level evolutionary processes to mechanisms of innate immunity—shape the genomic composition and adaptive potential of RNA viruses. Finally, the third chapter explored the use of genome engineering in MAYV as an experimental tool through the generation of synthetic viral variants capable of expressing a CRISPR/Cas9 guide RNA targeting ZAP. Although efficient gene editing was not detected under the conditions tested, these results demonstrate the feasibility of using MAYV as a platform for the expression of small RNAs and highlight its potential as an experimental system for functional studies.