Utilización de tecnologías de secuenciación de tercera generación para la caracterización de microorganismos

Abstract

Uno de los desafíos más urgentes que enfrentan los sistemas de salud a nivel global es la resistencia a los antimicrobianos (RAM). Esta problemática tiene asociadas consecuencias tanto clínicas como económicas para los países, por lo que se han creado guías para la implementación de su vigilancia mediante la identificación de clones de alto riesgo, así como la caracterización de genes que codifican determinantes de resistencia a antimicrobianos y factores de virulencia a través del uso de la genómica en combinación con las metodologías clásicas. El ambiente también juega un rol importante en la diseminación de la RAM. Diferentes especies portadores de genes de resistencia colonizan silenciosamente la microbiota intestinal de poblaciones sanas las cuales alcanzan las aguas residuales urbanas y son sometidas a presiones selectivas por agentes antimicrobianos, metales y desinfectantes allí presentes, convirtiendo el saneamiento en un hot spot para la transferencia horizontal de genes de RAM. En este sentido, la implementación de tecnologías de secuenciación portables de tercera generación podrían significar un avance para la caracterización de determinantes de resistencia de forma rápida así como de especies patógenas relevantes para la salud, incluso en el mismo lugar de la toma de la muestra. La metagenómica permite el estudio de la estructura de las comunidades microbianas y la detección de genes de RAM del ambiente así como la caracterización de microorganismos no cultivables y/o desconocidos. A pesar de la disminución de los costos asociados a esta metodología, aún se requieren de procedimientos de relevamiento taxonómico rápido y de bajo costo con capacidad de identificación de alta resolución a nivel de especie. Una de las metodologías más utilizada es la secuenciación del gen 16S del ARNr para la detección primaria de microorganismos procariotas a partir de muestras humanas, animales y el ambiente. El presente trabajo se basa en la implementación de la tecnología de secuenciación Oxford Nanopore Technologies (ONT) para la caracterización genómica de microorganismos procariotas y virales. Específicamente se realizó el análisis genómico retrospectivo de aislamientos recuperados de un brote nosocomial causado por K. pneumoniae ocurrido en el año 2017 en una institución hospitalaria local. A partir de los datos genómicos generados exclusivamente con la plataforma portable se obtuvieron secuencias plasmídicas completas donde se identificaron múltiples genes de resistencia, siendo los que codifican para las carbapenemasas KPC-2 y NDM-1 (CR-Kp) los más relevantes desde el punto de vista clínico. La generación de genomas de alta resolución con la incorporación de datos de secuenciación de segunda generación, permitió que se identificara el clon CR-Kp ST-11 O2v1:KL64 de distribución global como causante del brote intrahospitalario. Las tecnologías de secuenciación portables de tercera generación también han sido extensamente utilizadas para la secuenciación de genes marcadores debido a la posibilidad de obtener la secuencia completa del mismo. En este contexto, se desarrolló porefile un pipeline automatizado para la generación de perfiles taxonómicos a partir de datos de secuenciación de tercera generación del gen 16S del ARNr completo. Porefile clasifica las lecturas de secuenciación en base al algoritmo LCA (por lower common ancestor) e implementa un paso adicional de pulido a nivel de especie a partir de una base de datos reducida con la finalidad de mejorar la abundancia relativa recuperada a este nivel taxonómico. Utilizando datos simulados, porefile mostró resultados similares a los obtenidos con EMU, una herramienta basada en el algoritmo EM (por expectation-maximization), en cuanto a la detección a nivel de especie y recuperación de la abundancia relativa esperada de una comunidad de prueba de alta y baja complejidad. Asimismo, mostró niveles similares de recuperación de la taxonomía y abundancia relativa de los géneros más representados cuando se compararon los resultados obtenidos a partir de la región V1-V9 con datos ONT y la región V3-V4 con datos generados con tecnología Illumina para muestras de la microbiota intestinal humana obtenidas de base de datos públicas. Por otra parte, la genómica ha sido una herramienta fundamental para la vigilancia de variantes de SARS-CoV-2 en el contexto de la reciente pandemia global de COVID-19. La plataforma portable de ONT ha sido utilizada para la caracterización viral en varias regiones del mundo, incluso en regiones de menores ingresos. Si bien aún queda un largo camino por recorrer en cuanto a la implementación de la vigilancia genómica a escalas comparables a las regiones de mayores ingresos, es necesaria la generación de metodologías que permitan realizar la vigilancia de patógenos de forma rápida, confiable y costo-efectiva mientras este camino es recorrido. En este contexto se realizó la caracterización de los primeros genomas de SARS-CoV-2 obtenidos a nivel local en conjunto con otras secuencias uruguayas presentes en la base de datos GISAID correspondiente al mes de marzo del 2020. A partir de estudios filodinámicos, se observaron múltiples introducciones durante el mes de marzo en Uruguay desde distintas regiones que incluyen Sudamérica, Norteamérica y Asia. A su vez, se estima que el virus ya circulaba en el país desde fines de febrero del 2020. Finalmente, se utilizó tecnología ONT para la generación de secuencias consenso del gen que codifica para la proteína S de SARS-CoV-2. Debido a que gran parte de las mutaciones que definen a una variante de preocupación se encuentran en el gen S, se implementó un protocolo para la preparación de amplicones solapantes del gen S completo de SARS-CoV-2. Al utilizar esta estrategia, se pudo clasificar gran parte de las muestras en un ensayo piloto, por lo que la metodología podría utilizarse para la clasificación rápida y costo-efectiva de las variantes virales e incluso podría aplicarse a otros marcadores moleculares.