Comparación de dos métodos de extracción de líquido ruminal (fístula vs sonda) a partir de la población bacteriana obtenida en vacas primíparas durante el período de transición

Abstract

La búsqueda de mejorar la eficiencia y sustentabilidad de la producción lechera ha llevado a investigar el complejo sistema del microbioma ruminal, y en este contexto, la extracción de muestras de líquido ruminal representa un paso crítico. El método estándar de extracción es por medio de fístula ruminal, ofrece un muestreo preciso, pero implica un cuestionamiento metodológico ante el bienestar animal y mayor dificultad de realizar muestreos masivos, ya que implica cirugía a nivel del hueco del ijar. Como alternativa, la sonda oro-ruminal es un método menos invasivo y más práctico para obtener múltiples muestras. El objetivo fue comparar el uso de sonda oro-ruminal frente a fístula ruminal como metodología de muestreo para caracterizar la comunidad microbiana procariota del rumen en vacas Holando primíparas durante el periodo de transición, evaluando similitudes y diferencias en la composición y estructura microbiana en tres momentos alrededor del parto (-30, +35 y +65 días). Nueve vaquillonas Holando-americano canuladas en rumen se sometieron a extracción de líquido ruminal mediante ambos métodos en los tres momentos en torno al parto. Las muestras se realizaron en el horario de la mañana con los animales en ayuno. Cada muestra se colocó en un tubo estéril y rotulado de 50 ml. Estas muestras se centrifugaron a 10.000 rpm, 4°C, durante 10 minutos y se extrajo el material sedimentado con la utilización de pipetas estériles, trasegando en 2 frascos (estériles y debidamente rotulados) de 2 ml cada uno. Estos frascos pequeños son la muestra evaluada y se conservaron a -80°C. La población microbiana de cada muestra se detectó mediante la amplificación de las regiones variables V3-V4 del gen 16S y su secuenciación paired-end con la plataforma MiSeq de Ilumina. El objetivo fue agrupar las secuencias a nivel de ASVs (Amplicon Sequence Variants) para lograr caracterizar los grupos taxonómicos a nivel de géneros microbianos mediante la base de datos pública Silva (versión 138.2). Para los análisis estadísticos se utilizó el paquete DADA2 del software estadístico R (versión 4.3.1). Las curvas de rarefacción demostraron que la profundidad de secuenciación fue adecuada. La riqueza y la diversidad de ASVs y de géneros microbianos no presentaron diferencias significativas entre métodos de muestreo (p >0,05). Las correlaciones medias de Pearson y Spearman según el momento de muestreo para las abundancias relativas de géneros microbianos mediante fistula y sonda fueron altas (r >0,7), pero disminuyeron desde el preparto hacia el posparto. El análisis de expresión diferencial demostró que ninguno de los géneros evaluados presentó diferencias entre métodos (padj >0,05). El %CV de las abundancias relativas de géneros entre los métodos de muestreo aumentó según el momento de muestreo, pasando de 8,7% en el momento -30 a 15,4% en +35, y 26,6% en +65. En promedio la sonda compartió el 85,8% de los géneros centrales que detecta el método de extracción por fístula. El uso de sonda oro-ruminal, logró caracterizar 12 y ofrecer una buena señal biológica sobre los microorganismos del líquido ruminal, lo que alienta a sugerir que es una alternativa confiable para evaluación del ambiente ruminal.