Desarrollo de un nanobiosensor para la detección de lipoperóxidos

Abstract

Los lipoperóxidos (LOOH) son especies reactivas del oxígeno que derivan de la oxidación parcial de ácidos grasos poliinsaturados. Niveles altos de lipoperóxidos están asociados al desarrollo de diversas patologías. Actualmente, estas moléculas son detectadas por métodos invasivos de punto final que perturban la integridad celular y no permiten elucidar de forma específica el sitio donde estas se forman. En este contexto, los biosensores redox basados en proteínas fluorescentes representan una alternativa poderosa por su resolución espacio-temporal, especificidad y reversibilidad. Previo a este trabajo, se desarrolló un biosensor recombinante de LOOH formado por una peroxidasa específica de lipoperóxidos unida mediante un linker flexible a la proteína fluorescente redox sensible roGFP2. Luego de haber demostrado la funcionalidad del biosensor tanto in vitro como in cellula, el objetivo de este trabajo es el de expandir su rango de aplicaciones en sistemas biológicos, formulándolo en nanopartículas (NPs). De esta manera, no solo se podría utilizar en células transfectadas, sino también en células diferenciadas, cultivos primarios y organismos, evadiendo así la necesidad de transfección. Para la vehiculización del biosensor se utilizaron NPs de sílica biomimética (SiNPs), optimizando su protocolo de síntesis y obteniendo nanopartículas monodispersas de 100-300 nm. Posteriormente, se procedió a la obtención de nanobiosensores (biosensor vehiculizado en NPs), evaluando tres estrategias de formulación en las SiNPs: atrapamiento, adsorción electrostática e inmovilización covalente. Se lograron eficiencias de encapsulación/inmovilización entre 20% y 60%, destacando la estrategia de unión covalente por su adecuada carga absoluta de proteína, buena estabilidad coloidal y menores tamaños de NPs (de 230 nm), por lo que se ahondó en su caracterización fisicoquímica. Los resultados obtenidos por espectroscopía de infrarrojo de estos nanobiosensores indicaron la incorporación del biosensor en la superficie de las SiNPs, observándose una morfología esférica en imágenes de microscopía electrónica de transmisión. Asimismo, se verificó la actividad in vitro del nanobiosensor mediante espectrofluorimetría frente al oxidante H2O2, lo cual permitió avanzar hacia los ensayos en células de hepatocarcinoma humano HepG2. Luego de haber determinado un IC50 de 650 μg/mL, se estudió su internalización por microscopía confocal, observándose señal correspondiente al biosensor localizada en el interior celular. Este resultado se constató mediante Z-Stack, la cual a su vez co-localizó en algunos casos con la señal obtenida para marcador de lisosomas (LysoTracker). Finalmente, se demostró que el nanobiosensor internalizado es funcional in cellula: respondió rápidamente a DTT y a hidroperóxido de cumeno, mostrando un desempeño superior a la sonda química Bodipy C11 581/591. Esto confirmó su capacidad para reportar variaciones en el estado redox asociadas a lipoperoxidación en células no transfectadas.