Papel de las vesículas de membrana externa en bacterias uropatógenas

Abstract

Escherichia coli y Proteus mirabilis son los principales patógenos responsables de las infecciones del tracto urinario, que afectan a una gran proporción de personas en el mundo. Las bacterias gram-negativas son capaces de producir vesículas de la membrana externa (VME). Estas VME pueden actuar como un sistema de delivery bacteriano, proporcionando la posibilidad de exportar ADN, ARN, lípidos, proteínas y toxinas, entre otros. Las VME pueden participar en la producción de biofilm, la adquisición de nutrientes y en la protección inmunitaria de la bacteria, siendo el objetivo de varios antimicrobianos y fagos. Las VME podrían actuar en la patogenia de la infección, como intermediarias en la comunicación bacteriana, así como cargar diversos factores de virulencia. El objetivo de este trabajo consistió en evaluar la producción, composición y posible función de las VME en dos cepas uropatógenas de aislamientos clínicos. Para ello se emplearon las cepas de E. coli U144 y P. mirabilis 2921 ampliamente caracterizadas previamente, cultivadas en caldo Luria-Bertani (LB) y orina artificial (OA). Las VME fueron purificadas mediante filtración y ultracentrifugación y posteriormente caracterizadas en tamaño y carga superficial por DLS (ZetasizerZS) y mediante imagenología por TEM (STEM Inspect F50). El contenido proteico fue analizado por espectrometría de masas de alta resolución empleando la estrategia de shotgun, en un nano- LC MS/MS. El análisis de los péptidos y las proteínas se realizó con el software PatternLab for Proteomics 4.0. Para los ensayos de comunicación, las suspensiones bacterianas (OD600/0.5) de E. coli, P. mirabilis y E. coli ATCC se incubaron durante 30 min, 1, 3 y 5 horas con VME marcadas con el fluoróforo FM4-64 para evaluar la asociación de las VME con las bacterias. La tasa de asociación se obtuvo mediante la cuantificación de la fluorescencia bacteriana adquirida observada después de la incubación. Finalmente, se evaluó el efecto de las VME sobre la formación de biofilm mediante el método del cristal violeta. Las VME de E. coli tuvieron un tamaño de 185.5 y 257.6 nm en LB y OA, respectivamente. Mientras tanto, las VME de P. mirabilis midieron 267.6 y 320.4 nm. Todas las VME tuvieron un potencial zeta negativo. El análisis proteómico identificó 282 y 353 proteínas en las VME de cultivos de E. coli y P. mirabilis en LB, y 215 y 103 proteínas cuando se cultivaron en OA, respectivamente. La mayoría de las proteínas provenían de la envoltura de la bacteria, con algunas relacionadas con la movilidad y la adhesión. La composición de las proteínas de las VME difiere en función del medio de cultivo, con proteínas relacionadas con la captación de zinc y hierro que podrían desempeñar un papel importante en la OA. En relación con la asociación de VME, E. coli fue capaz de aceptar sus propias VME después de 30 minutos de incubación, mientras que P. mirabilis tarda más de 3 horas en aceptar sus propias VME. Curiosamente, E. coli ATCC fue capaz de aceptar tanto las VME de E. coli como las de P. mirabilis en 30 min y 3 h, respectivamente. La diferencia en la asociación observada podría implicar roles diferentes para las VME, una vesícula estaría implicada en la comunicación intraespecífica y la otra en la comunicación interespecífica. Al evaluar la formación de biofilm, observamos un aumento significativo en la biomasa cuando E. coli y P. mirabilis se incubaron con sus propias VME. Concluimos que E. coli y P. mirabilis uropatógenas producen VME que participan en la comunicación bacteriana intra e inter especie y mejoran la formación de biofilm. Estos resultados nos permiten avanzar en nuestra comprensión del rol de las VME en la patogénesis de las infecciones del tracto urinario.