Análisis funcional de los genes BAG en Physcomitrium patens

Abstract

El cambio climático representa uno de los mayores desafíos ambientales con consecuencias profundas y generalizadas para diferentes ecosistemas y por ende para la sociedad humana. El cambio climático se manifiesta a través de fenómenos extremos como la alteración de los patrones de precipitaciones, la acidificación de los océanos y el aumento de las temperaturas globales. Estas variaciones climáticas afectan directamente al crecimiento de los cultivos, lo que puede tener consecuencias devastadoras para la producción de alimentos. Entender cómo las plantas toleran estas condiciones adversas es vital para desarrollar estrategias que mitiguen el impacto del cambio climático. La familia Bcl-2-associated athanogene (BAG) ha sido identificada como un grupo evolutivamente conservado de co-chaperonas que regulan procesos celulares clave, incluyendo la muerte celular programada (PCD) y las respuestas al estrés. Estudios recientes han identificado el papel de los genes BAG de las plantas en estos procesos. Sin embargo, su función en la tolerancia al estrés, especialmente en plantas primitivas como los musgos, sigue sin explorarse. Estudios previos sobre Physcomitrium patens, llevados a cabo en el laboratorio en donde se realizó este trabajo, han proporcionado información sobre la estructura, organización y perfiles de expresión de los genes BAG bajo varios tratamientos de estrés. Se identificaron diez genes PpBAG, cuatro de los cuales (PpBAG1-3 y PpBAG8) mostraron una inducción significativa en respuesta al estrés térmico (37 °C) y durante la recuperación del mismo. Este incremento en su expresión se correlacionó con la inducción de genes autofágicos, como ATG8 y NBR1, lo que sugiere un posible papel en la regulación de la autofagia bajo condiciones de estrés. Para investigar más a fondo, en este trabajo de tesis, utilizamos la tecnología CRISPR-Cas9 para generar mutantes knockout para PpBAG1-3 y PpBAG8. Diseñamos cuatro ARNs guía dirigidos a estos cuatro genes, cuidando la selección de sitios off-target, y los clonamos en plásmidos pMK-Cas9 y pMH-Cas9. Se optimizaron técnicas de transformación de protoplastos de P. patens (de tipo salvaje y una línea PpATG8e::GFP-PpATG8e). Se optimizaron técnicas de screening mediante análisis por PCR para las transformaciones realizadas en el genotipo salvaje, logrando transformaciones exitosas y validando mutaciones en PpBAG3. por secuenciación de Sanger. Los resultados obtenidos hasta el momento revelan la eficiencia del sistema CRISPR-Cas9 en P. patens y confirman su potencial para la generación de las líneas knockout, abriendo la posibilidad de explorar el uso de los genes PpBAG en cultivos de interés agronómico para aumentar su tolerancia al estrés térmico y mitigar los efectos del cambio climático.