Desarrollo de sensores basados en proteínas fluorescentes para la detección no invasiva y dinámica de cambios redox y nucleótidos cíclicos en tripanosomátidos

Abstract

La gran mayoría de los procesos celulares como por ejemplo, la síntesis de proteínas, el metabolismo energético, el ciclo celular, la proliferación, diferenciación y muerte, están sujetos a regulación mediante mecanismos que involucran a iones y diferentes biomoléculas relacionadas el metabolismo energético (ATP, nucleótidos cíclicos) y redox (NADPH, tioles de bajo peso molecular). Descubrimientos recientes han demostrado que estas vías de señalización operan de manera dinámica y cruzada para lograr un control fino de la respuesta celular. Por lo tanto, el monitoreo en tiempo real y de manera no invasiva de estas señales representa un desafío biotecnológico importante, ya que estas herramientas permitirían identificar blancos moleculares y estrategias de intervención sobre funciones celulares específicas. El descubrimiento y la caracterización bioquímica y estructural de las proteínas fluorescentes, permitió manipular genéticamente las mismas para convertirlas en sensores con alta especificidad para traducir señales del entorno (desde pH y temperatura a metabolitos específicos) principalmente por cambios en su espectro de fluorescencia. Con la finalidad de diseñar biosensores capaces de detectar cambios redox y niveles de nucleótidos cíclico en tripanosomátidos, se propone el desarrollo de un biosensor con corrimiento espectral hacia el rojo (rxmRuby2), que permita el monitoreo dinámico y no invasivo del estado redox intracelular, con aplicaciones en imagenología in vivo y compatibilidad con otros fluoróforos, y se propone el desarrollo de un biosensor FRET que detecte simultáneamente cambios redox y AMPc (INF-RXM). Los ensayos in vitro e in vivo demostraron que el biosensor rxmRuby2 permite detectar cambios redox intracelulares en T. brucei, equilibrándose con el par TS2/T(SH)2 y evidenciando estrés oxidativo en parásitos aislados de sangre. La generación de una variante ratiométrica no fue lograda, pero la línea reportera desarrollada tiene gran potencial para estudiar la biología de tripanosomátidos e identificar nuevos blancos terapéuticos en combinación con otros biosensores. El desarrollo de un sensor dual estuvo basado en el par Clover/rxmRuby2, con mejor relación señal/ruido y compatibilidad espectral (INF-RXM). Se logró expresar y purificar la forma soluble del biosensor en E. coli, aunque con baja eficiencia y pérdida de fluorescencia de rxmRuby2, posiblemente por cambios conformacionales que afectan su cromóforo. Se logró validar la funcionalidad del sensor dual en Leishmania tarentolae, permitiendo la detección de cambios redox y de AMPc. Experimentos con el inhibidor de fosfodiesterasas ACG 29.3 confirmaron la producción basal de AMPc en L. tarentolae y validaron el modo de acción del compuesto. Se comprobó que forskolina e IBMX no inducen acumulación de AMPc en Leishmania, reafirmando diferencias en la regulación de este nucleótido entre tripanosomátidos y mamíferos. En este contexto, los sensores fluorescentes genéticamente codificados constituyen instrumentos muy potentes para seguir la evolución espacio-temporal de manera no invasiva de la dinámica de eventos moleculares que ocurren in vivo.