La actividad ribonucleasa modula el reconocimiento inmune del exRNA desnudo y determina la composición del exRNA no vesicular

Abstract

En los últimos años se ha consolidado la idea de que el RNA extracelular (exRNA) podría desempeñar un papel clave en la comunicación intercelular, esto está revolucionando múltiples áreas de la biología. El exRNA puede encontrarse dentro de vesículas extracelulares o en la fracción no vesicular, ya sea asociado a ribonucleoproteínas o como exRNA desnudo. Se ha considerado que el exRNA no vesicular carece de relevancia funcional, debido a su susceptibilidad a la degradación por ribonucleasas extracelulares (RNasas). Sin embargo, estudios previos de nuestro grupo, resultados de esta tesis de doctorado y de otros investigadores demuestran que la mayoría de los exRNAs son de hecho no vesiculares. En esta tesis de doctorado aportamos evidencia que sugiere que las células liberan gran parte de su transcriptoma al espacio extracelular no vesicular. Esta observación plantea una interrogante fundamental: ¿pueden las células detectar y responder al exRNA no vesicular y en particular al exRNA desnudo? La membrana plasmática es considerada una barrera física para la captación de exRNAs desnudos. Aunque ciertos tipos celulares podrían internalizar espontáneamente exRNA desnudo, el delivery funcional al citosol celular ha sido raramente observado. En esta tesis demostramos que las RNasas extracelulares, derivadas principalmente del suero fetal bovino utilizado como suplemento en cultivo celular, han oscurecido el estudio de la funcionalidad del exRNA desnudo. En presencia de un inhibidor activo de ribonucleasa (RI) observamos que el RNA bacteriano desnudo desencadena una potente respuesta proinflamatoria cuando se lo añade al medio de cultivo de células dendríticas y macrófagos. Mediante aproximaciones farmacológicas y genéticas, demostramos que la respuesta depende principalmente de la acción de los receptores endosomales de la familia Toll-like receptors. Además, también demostramos que el exRNA desnudo puede escapar de los endosomas y ser reconocido por sensores citoplasmáticos de RNA como RIG-I o MDA5 y llamativamente también por ribosomas. En este sentido, mRNAs extracelulares desnudos que codifican proteínas reporteras pueden ser internalizados espontáneamente y traducidos por diversos tipos celulares, de manera dependiente de RI. In vivo, el exRNA desnudo administrado de forma sistémica por vía intravenosa, compartimento rico en RNasas, estimula la activación de células inmunes innatas y adaptativas del bazo, y estos efectos se ven potenciados por la co-inyección de RI. Por otro lado, observamos que en compartimentos pobres en RNasas, como la cavidad peritoneal, el exRNA desnudo posee un efecto proinflamatorio intrínseco, independiente de la presencia de inhibidores de RNasas. En conjunto, y en contraste con lo que se consideraba previamente, los resultados de esta tesis de doctorado demuestran que el exRNA desnudo es bioactivo por sí mismo y no requiere encapsulación en vesículas lipídicas, sintéticas o biológicas, para su captación y funcionalidad celular. Estos hallazgos respaldan fuertemente la hipótesis de una forma de comunicación intercelular mediada por exRNAs desnudos que está supeditada a la presencia/ausencia de RNasas. Además, nuestros estudios aportan evidencia de que las múltiples RNasas presentes en el espacio extracelular podrían haber evolucionado como un mecanismo para controlar y regular los niveles de exRNAs desnudos circulantes, ya sea de origen endógeno o patógeno, y así evitar respuestas inflamatorias sistémicas que podrían contribuir a desencadenar o exacerbar patologías autoinflamatorias o autoinmunes.