Explorando estrategias de edición génica para promover el reemplazo alélico en soja

Abstract

La soja es uno de los cultivos más relevantes para Uruguay, siendo el que mayor superficie de siembra ocupa y encabezando desde hace más de 20 años el rubro exportaciones. El déficit hídrico y otros factores de estrés afectan la productividad de este cultivo, la cual suele ser menor en Uruguay que la reportada para otros países de la región. Las nuevas tecnologías de edición génica han demostrado un enorme potencial para contribuir al mejoramiento genético de los cultivos. Estas tecnologías, principalmente las basadas en el sistema CRISPR/Cas, pueden utilizarse para introducir mutaciones en sitios específicos del genoma. Las mutaciones ocurren como resultado de la reparación de un corte a nivel de la doble hebra del ADN, generado específicamente por el sistema de edición génica. Los mecanismos de reparación del ADN incluyen aquellos que involucran la unión de extremos libres no homólogos (NHEJ), que predominan en células somáticas, o aquellos que dependen de la recombinación homóloga (HR), que operan principalmente en células sexuales mientras que suelen ser poco eficientes en células somáticas. El objetivo general de este trabajo es optimizar metodologías de edición génica basadas en HR en soja (Glycine max), con el fin de generar plantas editadas mediante reemplazo alélico utilizando el sistema CRISPR/Cas9. Para facilitar la selección de eventos editados mediante HR, se utilizó un modelo de resistencia a herbicida a fin de proporcionar un fenotipo fácil de identificar. En concreto, el abordaje experimental propuesto consistió en reemplazar un gen que codifica para 5-enolpiruvatoshikimato-3- fosfato sintasa (EPSPS), por una versión mutada del gen que codifica una enzima insensible al herbicida glifosato. Con ese objetivo, en este trabajo se buscó determinar si las mutaciones TIPS (Thr102-Ile + Pro106- Ser) o TIPA (Thr102Ile + Pro106-Ala) en la proteína codificada por el gen EPSPS1 de soja, confieren insensibilidad al herbicida glifosato. Para ello, se analizaron los niveles de expresión mediante RT-PCR semicuantitativo de plantas transgénicas de Arabidopsis thaliana, expresando una versión de la proteína conteniendo las mutaciones TIPS o TIPA. Posteriormente, se hicieron ensayos fenotípicos para evaluar la sensibilidad y el rendimiento de las plantas transgénicas tratadas con el herbicida glifosato. En segundo lugar, se generó una serie de vectores multipropósito (serie PiLuCas) para transformar raíces de soja de forma transitoria mediante Agrobacterium rhizogenes y de esa manera evaluar la factibilidad y eficiencia de obtención de eventos de reemplazo alélico. En el futuro se buscará iniciar el proceso para determinar la factibilidad, eficiencia y heredabilidad de eventos de reemplazo alélico en plantas enteras, mediante la introducción del sistema CRISPR/Cas9 en cotiledones de soja mediante la transformación estable por Agrobacterium tumefaciens.