Generación de bibliotecas mediante Golden Gate y selección de nanobodies para inmunoensayos

Abstract

En esta tesina se evaluó la implementación de una estrategia de clonado mediante Golden Gate para la generación de bibliotecas de nanobodies presentados en fagos filamentosos. Mediante esta estrategia, se generó una biblioteca a partir de las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de una llama inmunizada con distintos antígenos. Para evaluar la funcionalidad de la biblioteca, se realizó una búsqueda de clones que pudieran tener utilidad como herramientas analíticas para la vigilancia de microcistinas en agua. Las microcistinas (MCs) son toxinas producidas por cianobacterias de relevancia sanitaria y ambiental, por su potencial impacto en la calidad del agua y la salud pública. Desde el punto de vista analítico, son moléculas pequeñas y químicamente diversas, con numerosas variantes, y suelen encontrarse a bajas concentraciones en matrices ambientales. Por este motivo, el desarrollo de alternativas prácticas para su detección constituye un desafío vigente. A partir del inmunoensayo competitivo en formato ELISA disponible en el Laboratorio de Inmunología del Instituto de Higiene basado en el nanobody A2 (NbA2), se planteó avanzar hacia un formato no competitivo sustentado en el reconocimiento del inmunocomplejo NbA2/MC, uno de los antígenos incluidos en la inmunización, con el fin de evitar limitaciones inherentes al fenómeno de competencia tales como la necesidad de un ajuste exhaustivo de las concentraciones de reactivos y la fuerte dependencia del tiempo de reacción. La estrategia de selección de nanobodies incluyó una etapa de pre-adsorción para depletar clones que reconocieran NbA2 libre, y tras dos rondas de panning se logró identificar un clon anti-inmunocomplejo, NbK3, que no presentó reactividad cruzada con NbA2 libre. El nanobody se expresó y purificó, fue caracterizado por ELISA y por interferometría de biocapa, determinándose una constante de afinidad (KD) de 1,05 × 10⁻⁸ M. Con NbK3 como reactivo de detección se desarrolló un ELISA no competitivo. La optimización evidenció el impacto de la estrategia de inmovilización, determinándose que la captura orientada de NbA2 biotinilado sobre estreptavidina redujo el SC₅₀ ~6 veces respecto a la adsorción directa, y se ajustaron condiciones como la concentración del reactivo de detección y el buffer de dilución de muestra para maximizar la señal específica y adaptar el ensayo a la detección en muestras de agua. El ensayo presentó reactividad cruzada elevada con variantes frecuentes y menor reconocimiento de congéneres más hidrofóbicos, delimitando el reporte como equivalentes de MC-LR, la variante empleada para la curva de calibración. En matrices fortificadas, las recuperaciones a 0,1 μg/L fueron variables con promedio cercano a 100%, y la precisión intra- e inter-ensayo se mantuvo dentro de los rangos aceptados presentando coeficientes de variación ≤ 15%. En conjunto, los resultados sustentan la viabilidad del enfoque anti-inmunocomplejo propuesto para el desarrollo de un ensayo no competitivo, y deja planteadas las etapas necesarias para su consolidación y transferencia a formatos más accesibles para su uso en campo.