Estrategias para incrementar la actividad agonista de anticuerpos monodominio anti-CD40

Abstract

El cáncer sigue siendo una de las principales causas de mortalidad a nivel mundial y, a pesar de los avances en terapias convencionales, persisten limitaciones asociadas con recurrencia tumoral, resistencia y efectos adversos. En este contexto, la inmunoterapia representa una estrategia prometedora para mejorar los resultados clínicos. Entre las aproximaciones inmunoterapéuticas, los anticuerpos agonistas dirigidos a receptores inmunoestimuladores han mostrado un gran potencial terapéutico. Un blanco relevante es CD40, un receptor transmembrana de la familia TNFRSF, expresado principalmente en células presentadoras de antígeno (APCs). La activación de CD40 mediante anticuerpos agonistas estimula robustamente a las APCs, potenciando respuestas de células T citotóxicas y B, y transformando tumores “fríos” en “calientes”. La mayoría de los anticuerpos anti-CD40 utilizados son IgG enteras convencionales, que dependen de la unión a FcɣRIIB para el entrecruzamiento del receptor y, por lo tanto, para su actividad. Nuestro grupo ha seleccionado anticuerpos monodominio (nanobodies (Nb)) derivados de Lama glama, que reconocen el receptor CD40 de ratón. Dado que se asumió que los formatos monovalentes no presentarían actividad agonista, se generaron constructos multivalentes trimerizados mediante el dominio foldon de la fibritina del fago T4 (Nb-foldon) o bivalentes fusionados a la región Fc de la IgG1 murina (Nb-m1Fc). Estudios iniciales mostraron que los Nb-foldon eran activos únicamente in vitro, probablemente debido a su baja estabilidad y corta vida media, mientras que Nb-m1Fc demostraron eficacia tanto in vitro como in vivo, aunque con margen de optimización para reducir las dosis requeridas. En este trabajo se introdujeron modificaciones en ambos constructos para mejorar su desempeño. En el caso de los Nb-foldon se buscó estabilizar el trímero incorporando residuos de cisteína que dieran lugar a enlaces covalentes entre cadenas, junto con la adición de un péptido terminal con afinidad por el receptor neonatal. Se optimizó la producción de estas construcciones en células HEK293 constatándose la formación de trímeros covalentes, aunque en forma minoritaria. Los análisis funcionales demostraron una mayor actividad in vitro respecto al trímero no covalente y, al evaluar su uso como adyuvantes en experimentos de inmunización in vivo con un antígeno modelo, se observó un indicio de cambio de clase de inmunoglobulinas, aunque sin evidencia de una respuesta T específica. En el caso de los Nb-m1Fc se generaron nanobodies que reconocen diferentes epítopes asociados a IgG1 murina, 4-2B, 1-2B y D9m1Fc, siendo el clon 1-2B el que exhibió una mejor actividad agonista in vitro. Contemplando antecedentes donde el aumento de la valencia juega un rol importante en el agonismo de CD40, se generaron versiones de anticuerpos multivalentes, entre ellas versiones biparatópicas que combinan Nbs que reconocen diferentes epítopes en fusión con la región Fc de IgG1 murina, así como una versión con un Fc silenciado. Adicionalmente, se generó un anticuerpo tetravalente monoparatópico basado en el clon 1-2B. Los estudios in vitro indicaron que el aumento de la valencia potencia la activación del receptor, aunque la configuración geométrica y la orientación de los epítopes parecen desempeñar un papel determinante. El constructo tetravalente monoespecífico mostró mayor actividad que el biparatópico, sugiriendo que la organización espacial de los sitios de unión puede ser clave para optimizar el agonismo. Además, el anticuerpo con un Fc silencioso conservó actividad independiente de Fc, evidenciando que la multivalencia por sí sola puede inducir el entrecruzamiento del receptor. Estos resultados demuestran que la ingeniería de anticuerpos para nanobodies agonistas de CD40 permite optimizar su actividad funcional y ampliar las aplicaciones de la inmunoterapia basada en receptores coestimuladores, tanto como adyuvantes en vacunas como en terapias oncológicas.