Expresión y purificación de los dominios EF del receptor nuclear Eg2DBDß y aproximación al estudio de ligandos

Abstract

La equinococosis quística (EQ), causada por la forma larvaria del complejo multiespecie Echinococcus granulosus sensu lato (platelminto cestodo), es una zoonosis mundial que causa grandes pérdidas económicas y continúa siendo clasificada por la OMS como una de las veinte enfermedades tropicales desatendidas. Los tratamientos no han sido muy efectivos debido a la baja eficacia de los mismos y al desarrollo paulatino de resistencia parasitaria, entre otras causas. Esta situación subraya la necesidad de encontrar nuevas estrategias terapéuticas que se dirijan a blancos específicos del parásito que sean vitales para su supervivencia. En este contexto, los receptores nucleares (NRs) de E. granulosus s.l. podrían ser candidatos prometedores. Los NRs son moduladores transcripcionales que regulan procesos como el metabolismo, desarrollo y reproducción en metazoos. La mayoría de estos NRs están regulados por ligandos lipofílicos pequeños, como los ácidos grasos (AG). Además, en los platelmintos parásitos los NRs serían particularmente relevantes, ya que estos organismos son incapaces de sintetizar AG de novo, siendo incorporados desde los hospederos, de forma que estas proteínas regulatorias podrían participar de una vía de señalización mediada por estos lípidos. Los Eg2DBDs son NRs que pertenecen a la subfamilia 2DBD (con dos dominios de unión al ADN), la cual no está presente en vertebrados, como los hospederos del parásito, lo que los convierte en blancos terapéuticos atractivos. Asimismo, los NRs de helmintos parásitos están siendo considerados como posibles blanco de drogas antihelmínticas, dado que estas moléculas desempeñan funciones claves en las redes transcripcionales del metabolismo y del desarrollo de estos organismos. Nuestro grupo de investigación identificó cuatro Eg2DBDs en E. granulosus s.l.: Eg2DBDα, Eg2DBDβ, Eg2DBDγ y Eg2DBDα.1, siendo esta última probablemente una isoforma de Eg2DBDα. Se ha determinado sus niveles de expresión en la forma larvaria de protoescólices (PE), siendo Eg2DBDα y Eg2DBDβ los de mayor expresión. Por otro lado, estudios bioinformáticos con Eg2DBDα.1 mostraron que uniría con mayor afinidad a AG insaturados como los ácidos oleico y linoleico. Además, se ha determinado que dicha proteína homodimeriza y este proceso es estimulado por el suero del hospedero intermediario (bovino), sugiriendo un posible rol en la comunicación hospedero-parásito. En este marco, nuestro objetivo general se centra en contribuir al conocimiento del mecanismo de acción de Eg2DBDβ de Echinococcus granulosus s.l., mediante la determinación de su capacidad de unión de AG. En este trabajo nos planteamos expresar y purificar la región codificante para los dominios E y F (dominio de unión al ligando y C-terminal) de Eg2DBDβ, y evaluar su capacidad de unión de un análogo de ácido graso fluorescente (BODIPY FL-C16) mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) nativo. Mediante este trabajo, se puso a punto una estrategia experimental para producir y purificar exitosamente a rEg2DBDβ-EF a partir de E. coli Rosetta (DE3), con un alto rendimiento. Por otro lado, demostramos que rEg2DBDβ-EF es capaz de unir un análogo de AG fluorescente mediante PAGE nativo, metodología que nos permitirá en un futuro realizar ensayos de desplazamiento o competición con AG no marcados. Este es un primer paso para poder avanzar en la identificación de los posibles ligandos e incluso de proteínas que interaccionan con Eg2DBDβ, como podría ser la proteína de unión a ácidos grasos EgFABP1. De esta manera, se aportará al conocimiento de la función de Eg2DBDβ y su rol potencial en la biología del parásito, contribuyendo a dilucidar una posible vía de transducción de señales mediada por AG del hospedero, donde podrían participar los Eg2DBDs y EgFABP1. Por otro lado, éstos y otros avances en esta línea podrán también sembrar las bases para el estudio de los Eg2DBDs como posibles candidatos terapéuticos.