Estudio funcional de la interacción CCDC28B-BBS4 y su impacto en la patogénesis del síndrome de Bardet-Biedl

Abstract

La cilia primaria es un organelo que actúa en forma de antena censando el medio extracelular y participando de diversas vías de señalización fundamentales para el desarrollo y mantenimiento de órganos y tejidos, como por ejemplo las vías de SHH (Sonic-Hedgehog), Wnt (Acrónimo de Wingless e Int1), IGF (Insulin-like Growth Factor 1) y PDGFα (Platelet-derived growth factor Alpha), entre otras. La participación en estos procesos, así como su presencia casi ubicua en células de mamíferos, la convierten en un organelo esencial, cuyo mal funcionamiento está asociado a un importante número de patologías complejas denominadas ciliopatías. Estas enfermedades presentan un amplio rango de fenotipos, incluyendo en muchos casos patologías de alto impacto en la salud pública como son la obesidad, diabetes, trastornos del comportamiento y poliquistosis renal. La presencia de estos fenotipos en un conjunto de enfermedades de transmisión genética permite utilizar a las ciliopatías como objeto de estudio para caracterizar y entender mejor algunos de estos problemas. El Síndrome de Bardet-Biedl (BBS) es una ciliopatía caracterizada por degeneración de retina, polidactilia, enfermedad renal y obesidad. Desde un punto de vista genético resulta un modelo interesante ya que, si bien en muchos casos se hereda como un rasgo autosómico recesivo, en distintas familias se ha demostrado que presenta un patrón de herencia oligogénica, donde mutaciones en más de un gen colaboran en el desarrollo del fenotipo. Hasta la fecha se han identificado 22 genes causales, muchos de los que a su vez participan en casos de herencia oligogénica. Por otro lado, se identificó a CCDC28B (Coiled coil domain containing protein 28B) como un modificador secundario del síndrome. En este caso, las mutaciones encontradas en CCDC28B no son suficientes para causar la enfermedad, pero sí para modificar su presentación en presencia de mutaciones en otros genes BBS. La mayoría de las proteínas BBS se ubican en la base de la cilia o dentro de la misma y en cuanto a su función, están involucradas en un gran número de procesos. En particular, hay un grupo de proteínas BBS que conforman un complejo octamérico (BBS1, BBS2, BBS4, BBS5, BBS7, BBS8, BBS9 y BBS10) denominado BBSoma, que participa en el ensamblado de la cilia mediando el transporte de proteínas de membrana hacia la base de la cilia y dentro de la misma. Uno de los focos de este trabajo de tesis es BBS4, una de las primeras proteínas BBS en ser caracterizada funcionalmente y con la cual nuestro grupo ha venido trabajando en el marco de su vínculo con el desarrollo de obesidad. Su deficiencia no provoca necesariamente la ausencia de cilias en los tejidos, pero sí genera defectos en el transporte de algunos receptores a la membrana ciliar, así como en la secreción de Follistatin like-1 (FSTL1), una glicoproteína que nuestro grupo y otros han mostrado que juega un rol en la diferenciación de adipocitos. La otra proteína central para este trabajo de tesis es CCDC28B, originalmente fue identificada por su interacción física directa con BBS4 en ensayos de doble híbrido en levadura, mostrando posteriormente que también es capaz de interactuar con otras proteínas BBS. En cuanto a su función, trabajos de nuestro grupo han mostrado que CCDC28B regula la formación y el largo de las cilias tanto in vitro como in vivo, en zebrafish. Dados estos antecedentes, nuestro grupo se ha planteado estudiar las consecuencias funcionales de la interacción ya conocida entre BBS4 y CCDC28B, tanto in vitro como in vivo concentrándonos fundamentalmente en el fenotipo de obesidad, de alta prevalencia en pacientes BBS y también presente en varios modelos murinos knockouts en genes BBS, entre ellos en los ratones Bbs4 -/-. La bibliografía hasta el momento describe a la obesidad, tanto en pacientes BBS como en el modelo murino Bbs4 -/-, como un producto de la afectación de las cilias en el Sistema Nervioso Central, particularmente en el hipotálamo, que genera una desregulación de la ingesta y consecuente hiperfagia. Sin embargo, poco se ha estudiado sobre el rol de la cilia y las proteínas BBS en los tejidos periféricos relevantes para la obesidad, como el tejido adiposo. De esta forma, el objetivo central de este trabajo fue continuar entendiendo por qué la disminución de CCDC28B en pacientes BBS resulta en una presentación más severa de la enfermedad. Para esto dividimos el trabajo en dos bloques principales. Por un lado, la caracterización más detallada del metabolismo energético y la funcionalidad del tejido adiposo en los ratones Bbs4 -/- frente a diferentes estímulos, y por otro lado, la generación de un modelo murino Ccdc28b -/- utilizando la tecnología de CRISPR/Cas9, que nos permitiera posteriormente recapitular la interacción génica observada en pacientes. Los resultados de esta tesis nos han permitido, en primer lugar, confirmar que el fenotipo de obesidad presente en el modelo Bbs4 -/- es generado como consecuencia de la hiperfagia, siendo corregido cuando se controla la ingesta. Además, al rescatar el fenotipo de ganancia de peso aumentada controlando la ingesta, pero estimulando el desarrollo de obesidad a la par, en animales Bbs4 -/- y controles, mediante la alimentación con dieta rica en grasa, no observamos diferencias en los dos grupos en cuanto al manejo sistémico de la glucosa. Sin embargo, sí pudimos identificar diferencias en algunos aspectos que resultan de sumo interés para entender la presentación de la obesidad en BBS, como por ejemplo, una disminución estadísticamente significativa en el nivel de ácidos grasos libres en sangre en los Bbs4 -/- con respecto a los controles, lo que podría indicar cambios en la capacidad de buffer o almacenamiento del tejido adiposo en estos animales. También identificamos diferencias en el manejo de la glucosa dependientes del sexo, observando peores resultados en machos que en hembras, pese a que estas últimas aumentan más rápidamente de peso. Además, los resultados de los experimentos de adipogénesis in vitro utilizando distintos tipos de precursores de adipocitos, mostraron que existe una capacidad aumentada de diferenciación en células Bbs4 -/-. En conclusión, más allá que la obesidad en este modelo es gatillada por un problema a nivel del Sistema Nervioso Central en la regulación de la saciedad, el funcionamiento del tejido adiposo también parece estar afectado. Como mencionamos, un segundo eje de este trabajo fue el desarrollo de un ratón Ccdc28b -/-. Nuestros resultados mostraron que la eliminación de CCDC28B resulta en un fenotipo leve, consistente con el rol de modificador secundario que le fue asignado a este gen en humanos. Por un lado, los ratones Ccdc28b -/- no presentan afectación estructural de las cilias, aunque sí hay diferencias leves en el largo de estos organelos en algunos tejidos. Por otro lado, no desarrollan degeneración de retina ni obesidad, dos fenotipos característicos de BBS. Interesantemente, los ratones Ccdc28b -/- sí presentan defectos comportamentales relacionados con la interacción social, así como patrones de comportamiento estereotipados consistentes con trastornos del espectro autista (TEA). Este hallazgo es relevante en el contexto de BBS ya que un número de trabajos han mostrado que existen trastornos del comportamiento en pacientes BBS. A su vez, nuestros resultados preliminares sugieren que el rol de Ccdc28b en el desarrollo de este tipo de patologías podría exceder a BBS, ya que cuando analizamos una base de datos de pacientes con TEA (Simmons Simplex Collection) también encontramos mutaciones en CCDC28B. En conclusión, este trabajo nos permitió desarrollar una nueva línea murina que no solamente servirá para modelar lo que sucede en pacientes BBS (generando dobles mutantes para una proteína causal, BBS4, y un modificador secundario, CCDC28B), sino que además se identificó una asociación novedosa entre CCDC28B y comportamientos relacionados con TEA, que permitirán continuar entendiendo las bases moleculares y genéticas de este grupo de trastornos.