Validación de un sistema CRISPR/Cas para la inactivación de genes in vivo

Abstract

El sistema CRISPR/Cas, inicialmente identificado como un sistema inmunitario adaptativo altamente eficiente frente a elementos genéticos extraños en procariotas, se ha convertido en una herramienta de edición genómica aplicable a cualquier organismo, lo que ha revolucionado el estudio de la función de genes in vitro e in vivo. La puesta a punto de este sistema representa un desafío experimental que implica la necesidad de contar con controles adecuados que permitan evaluar la eficiencia de la edición. Para esto, nuestro grupo diseñó un sistema para la inactivación de la proteína reportera mCherry utilizando componentes recombinantes y verificó su funcionalidad in vitro. Este trabajo busca evaluar la eficiencia de edición del sistema in vivo, mediante el seguimiento de la pérdida de fluorescencia en las células editadas. Con este fin, se generó una línea celular que expresa de manera estable la proteína mCherry. Para esto, se co-transfectaron plásmidos lentivirales en la línea celular HEK293T, y se transdujeron células DU145 con los lentivirus producidos. La expresión de mCherry en la línea DU145 transducida se verificó mediante microscopía de fluorescencia. Luego de la selección de estas células con puromicina, se determinó la intensidad de fluorescencia de las células mediante citometría de flujo. Posteriormente, se transfectaron los componentes del sistema CRISPR/Cas9 sintetizados in vitro (sgRNA, DNA molde) en las células DU145-mCherry mediante lipofección y electroporación. Finalmente, la eficiencia de edición se evaluó mediante citometría de flujo cuantificando los cambios de fluorescencia por célula luego de la edición. Por lipofección, no se detectaron cambios en la fluorescencia bajo las condiciones ensayadas. Sin embargo, al electroporar el sgRNA dirigido a mCherry sin un molde de DNA, el 10% de las células perdió fluorescencia. Esta proporción aumentó al 13% cuando se co-transfectó con DNA donante. Si bien no se estudió la edición genómica a nivel del DNA, los resultados sugieren que este sistema podría usarse para evaluar la funcionalidad in vivo de los componentes del sistema CRISPR/Cas sintetizados in vitro.