Implementación de una estrategia de edición genómica por CRISPR/Cas9 para obtener el knockout del gen de VTRNA1-2 en líneas celulares de cáncer de próstata

Abstract

El cáncer es una enfermedad fundamentalmente genética de gran preocupación a nivel mundial. Específicamente el cáncer de próstata es el cuarto de mayor incidencia considerando ambos sexos y la 3 causa de muerte en hombres en Uruguay por lo que existe demanda de nuevos biomarcadores que ayuden a su diagnóstico oportuno. Los ARNs de tipo bóveda o “vault” en inglés, (vtRNAs) son un grupo de pequeños ARNs no codificantes que más allá de asociarse con la partícula vault, cumplen múltiples funciones independientes de la misma. En humanos, existen cuatro genes de VTRNAs: VTRNA1-1, VTRNA1-2 y VTRNA1-3 se encuentran en el locus VTRNA1 y un cuarto , vtRNA2-1, se sitúa en un locus diferente, VTRNA2-1. De estos, vtRNA1-2 es, de acuerdo a bibliografía disponible, el vtRNA menos estudiado. El trabajo de nuestro grupo sugiere que podría ser oncogénico en la mayoría de los tejidos y parece ser el más desregulado de los 4 en cáncer lo que es motivo para estudiarlo en mayor profundidad. Al momento, solo un reporte indica un efecto pro-proliferativo, sin embargo resultados no publicados de nuestro grupo y del grupo colaborador de N.Polacek confirman este efecto y sugieren nuevo fenotipos oncogénicos. En esta tesina se buscó generar un modelo de estudio de pérdida de función de VTRNA1-2 en cáncer de próstata para estudiar su función. Se intentó el knockout del gen utilizando un sistema de edición génica CRISPR/Cas9 basado en plásmidos cedidos por investigadores colaboradores de nuestro grupo. El proceso consistió en la transfección de los plásmidos codificantes de la maquinaria de edición en dos líneas celulares que derivan de cáncer de próstata: LNCaP y PC3. Luego se enriquecieron los cultivos en células editadas utilizando el fármaco puromicina y se extrajo ADNg para evaluar la edición del gen. Se realizó el diseño de cebadores apropiados para amplificar la región del gen de vtRNA1-2 mediante PCR y nested PCR. Mediante electroforesis en geles de agarosa, se analizaron los productos pero no se identificaron bandas que evidenciaran la edición a nivel genómico de vtRNA1-2. Usando la misma estrategia para analizar la edición del gen de puromicina del plásmido de selección usado en sistema , tampoco se observó edición del mismo. Dado que la ineficiencia de la edición puede deberse a las secuencias guías del sistema utilizado, se analizaron los plásmidos utilizados así como los ARN guías codificados por estos y se identificaron otros ARNg con mejores posibilidades predictivas de conseguir edición en futuros experimentos. Dada la relevancia de obtener un línea celular de cáncer de próstata knockout para un posible oncogen como de vtRNA1-2, se discuten también otras estrategias de edición genómica por CRISPR como perspectiva.