Estrategias para la obtención de cepas mutantes de micobacterias aplicadas a generar mutantes para el gen de la fosfatasa PtpA, reconocido factor de virulencia de Mycobacterium tuberculosis

Abstract

Estrategia habitual para la generación de mutantes: Recombinación Homóloga Primera etapa: se genera una cepa que expresa recombinasas mediante electroporación de la cepa bacteriana con un plásmido que contenga las secuencias de éstas y resistencia a un antibiótico. Segunda etapa: se realiza una segunda electroporación con la finalidad de introducir el fragmento a recombinar, tratándose generalmente de fragmentos up y down stream del gen de interés a mutar y un cassette que confiere resistencia a otro antibiótico, lo que permite la selección posterior del mutante deseado. De esta forma se modifica el gen objetivo e inhibe su transcripción. ➢ Nueva estrategia para la generación de mutantes: CRISPR/Cas9 Única etapa: electroporación de la cepa bacteriana con dos plásmidos, uno con la información para la expresión del sistema Cas9-sgRNA y el otro plásmido que codifica una integrasa L5 de expresión constitutiva. Una de las ventajas principales de utilizar la estrategia CRISPR/Cas9 interferente es la posibilidad de modular simultáneamente la expresión de más de un gen insertando al genoma bacteriano un único plásmido que contenga la secuencia de dCas9 y diferentes sgRNAs (McCarty et al., 2020, doi: 10.1038/s41467-020-15053-x). Por otra parte, en CRISPR/Cas9i es necesario inducir al sistema de silenciamiento, por lo que se puede tener un fenotipo normal o mutado a voluntad propia. Pero también es posible quitar el plásmido CRISPR incorporado en el genoma de forma sencilla (Meijers et al., 2020, doi: 10.1016/j.tube.2020.101983).